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结直肠癌是全球常见的消化系统恶性肿瘤,其全球发病率居于肺癌和乳腺癌之后的第三位,死亡率居于肺癌、肝癌、胃癌之后的第四位。术后复发、转移是引起死亡的主要原因。因此,研究结直肠癌侵袭和转移的机制,是降低结直肠癌发病率和死亡率的有效途径。microRNAs是一类内源性小分子单链非编码RNA,通过降解mRNA或抑制其翻译对靶基因进行调控,在肿瘤中起到促癌或抑癌作用,研究miRNAs对其靶基因的调控作用对于结直肠癌的临床诊治具有重要意义。miR-760是本课题组前期在结直肠癌甲基化芯片中筛选获得的差异表达miRNA。目前,miR-760在结直肠癌中的研究报道较少,EphB3是我们用生物信息学筛选出的miR-760的候选靶基因。本课题旨在揭示一个miR-760与其靶基因EphB3调控结直肠癌进展的机制,为临床结直肠癌的诊治提供新的分子靶点。研究方法与结果1 miR-760在结直肠癌组织和细胞中的表达及其临床意义生物信息学预测miR-760在结直肠癌中低表达。荧光定量PCR检测miR-760在40例结直肠癌组织中低表达,其表达水平仅与淋巴结转移负相关。荧光定量PCR显示,miR-760在SW480、HT29中高表达,在SW620、HCT116中低表达。2 miR-760在体外结直肠癌细胞中的功能研究MTT、Transwell小室侵袭实验、平板克隆形成实验、细胞划痕实验证实,过表达miR-760后,结直肠癌细胞的生长增殖、侵袭能力减弱;干扰miR-760后,结直肠癌细胞的生长增殖、侵袭能力增强。3 miR-760靶基因EphB3的鉴定及相关性分析(1)miR-760靶基因的预测与双荧光素酶实验验证生物信息学预测EphB3是miR-760的靶基因,双荧光素酶报告系统验证miR-760靶向结合EphB3-3’UTR。荧光定量PCR及Western blot显示,过表达EphB3能有效逆转miR-760mimics对EphB3表达的抑制作用。(2)EphB3表达分析及其与miR-760相关性分析Western blot 显示 EphB3 在 SW620、HCT116 中高表达,在 SW480、HT29中低表达。EphB3与miR-760在结直肠癌细胞中的表达呈负相关关系。Western blot和荧光定量PCR均显示,转染miR-760 mimics后,EphB3的表达下调。生物信息学预测EphB3在结直肠癌中表达上调。免疫组织化学技术检测84例结直肠癌组织中EphB3过表达,且与淋巴结转移正相关,与不良预后相关。配对的40例结直肠癌组织中miR-760与EphB3表达负相关,且均与淋巴结转移相关。4 EphB3在体内外结直肠癌细胞中的功能研究MTT、Transwell小室侵袭实验、平板克隆形成实验、裸鼠皮下成瘤实验证实,稳定干扰EphB3后,体内外结直肠癌细胞的增殖、侵袭能力减弱。5 miR-760/EphB3促进结直肠癌进展的分子机制研究(1)流式细胞仪检测显示EphB3干扰后结直肠癌细胞出现G1期阻滞,荧光定量 PCR、Western blot 显示 P21 上调,E2F1、CDK6、CDK4 下调。(2)流式细胞仪检测显示EphB3干扰后结直肠癌细胞凋亡率升高,荧光定量 PCR、Western blot 检测 Caspase-3、Caspase-6、Caspase-8、Bax 上调。(3)免疫荧光技术显示EphB3干扰后结直肠癌细胞β-catenin、Vimentin、Nanog下调,E-cadherin上调,促进EMT及干性。(4)Westernblot、免疫共沉淀显示EphB3可与Ras-Rac信号通路的关键因子Tiam1发生相互作用,调控Ras-Rac信号通路。结论1miR-760在结直肠癌中低表达,其表达与淋巴结转移负相关。miR-760可抑制体内外结直肠癌细胞增殖、迁移。2在结直肠癌中,EphB3是miR-760的靶基因。EphB3表达上调,促进结直肠癌细胞增殖、迁移,且过表达EphB3与淋巴结转移及不良预后相关。3 miR-760/EphB3通过促进细胞周期进展,抑制凋亡,促进EMT,促进结直肠癌进展。其潜在机制可能是EphB3与Tiam1相互作用,激活Ras-Rac信号通路。