Oreixns,即hypocretins,是1998年分别由两个研究组同时发现的一种神经肽,orexin神经元主要位于穹隆周围的外侧下丘脑区。Orexin系统包括来自同一前体物质的二个单体orexin A (hypocretin 1)和orexin B (hypocretin 2),主要是通过活化两个G蛋白偶联受体orexin受体1和orexin受体2发挥作用。大量研究已经表明,orexins在促觉醒中发挥着关键性作用,这种促觉醒作用主要是通过兴奋多个皮层下觉醒系统及大脑皮层实现的。电生理研究显示,orexin神经元的活动受许多神经递质、神经调质和代谢信号的影响。研究证实,这些神经递质、调质及代谢信号对orexin神经元活动的调节在睡眠觉醒周期的调控中具有关键性作用。其中,神经调质――腺苷,由机体组织代谢活动产生的一种小分子物质,是目前研究最多、最重要的睡眠稳态调控因子,既可以直接作用于突触后腺苷受体、又可以改变突触前兴奋性或抑制性突触传递活动,影响神经元放电活动。文献报道,orexin神经元表达A1受体,但腺苷不能直接通过激活突触后A1受体改变神经元膜电位水平,而是通过结合突触前A1受体减少兴奋性谷氨酸能突触传入,调节orexin神经元的放电活动。除了谷氨酸能突触传递外,orexin神经元还接受大量的抑制性GABA能突触传递,这些抑制性纤维传入主要来自睡眠中心腹外侧视前区和外侧下丘脑区的局部中间神经元。然而,腺苷是否能调节orexin神经元上抑制性突触传递活动,是否存在内源性腺苷的释放调节orexin神经元上的突触传递活动,目前仍不清楚。此外,本室的前期钙成像实验显示,orexin A可以使少量培养的皮层神经元的胞内游离钙增加。同时,在电生理实验中,我们还发现orexin A能增加急性分离的前额叶皮层深层神经元的放电频率,但是,orexin A是否能影响前额叶皮层深层神经元的胞内钙水平及其作用机制,还需进一步的研究。本研究旨在通过膜片钳技术,深入研究腺苷对orexin神经元外侧下丘脑神经元上的抑制性突触传递活动的影响。首先,以orexin-EGFP转基因小鼠中的外侧下丘脑orexin神经元为研究对象,采用穿孔膜片钳技术,观察腺苷对诱发的抑制性突触后电流的影响及其受体和突触前机制。并进一步观察了不同刺激频率下内源性腺苷的释放。同时,在钙成像实验中,采用钙荧光指示剂fluo-4/AM负载急性分离的前额叶皮层深层神经元,结合药理学方法,观察orexin A对急性分离的前额叶皮层神经元的胞内钙影响及其作用机制。1.腺苷抑制诱发的orexin神经元上的抑制性突触后电流穿孔膜片钳记录显示,胞外灌流液中加入腺苷(100μM),能显著降低orexin神经元上诱发的抑制性突触后电流(evoked inhibitory postsynaptic currents, evIPSCs)幅度降至给药前的51.4241% (n=14,P<0.05)。这种抑制效应具有剂量依赖性,50μM、10μM、1μM腺苷加入后,幅度为给药前的56.8569% (n=7,P<0.05)、75.1114% (n=9,P<0.05)、93.0183% (n=6,P>0.05)。2.突触前A1受体介导腺苷对抑制性突触后电流的影响胞外液中预先加入腺苷A1受体拮抗剂CPT(200nM),evEPSCs幅度无明显变化(98.408% of control;n=9,P>0.05),加入腺苷50μM后,电流幅度未发生显著改变。同样,预先加入腺苷A2受体拮抗剂DMPX(10μM)后,并不影响evEPSCs幅度(99.351 % of control;P>0.05,n=8),但加入50μM腺苷后,电流幅度降低(59.139 % of control;P<0.05)。提示A1受体介导腺苷的抑制效应。分析配对脉冲比(paired-pulse ratio, PPR),加入腺苷50μM后,比值从1.095891增加到1.75679 (n=9,P<0.05)。实验进一步显示,腺苷50μM显著降低微小抑制性突触后电流(mini inhibitory postsynaptic currents, mIPSC)的频率,而不影响幅度。此外,腺苷并不能改变外源性给GABAA受体激动剂muscimol(50μM)产生的抑制性电流的幅度。提示腺苷主要是通过激活位于突触前的A1受体降低抑制性突触传递。3.突触活动依赖性释放的内源性腺苷抑制orexin神经元突触后兴奋性电流腺苷50μM显著降低orexin神经元上诱发的兴奋性突触后电流(evoked excitatory postsynaptic currents, evEPSCs)幅度。而在较低刺激频率下(0.033Hz,1Hz),CPT(200nM)加入前后,evEPSCs幅度无任何改变(n=9,P>0.05)。提高刺激频率,2Hz、3Hz、5Hz时,evEPSCs的幅度随着刺激时间(持续600s)而逐渐降低,加入CPT后,这种幅度的降低趋势无显著变化。10Hz,CPT在刺激后期能部分阻断电流幅度的降低(n=10,P<0.05)。而受体2拮抗剂DMPX(10μM),不能阻断电流幅度的降低(n=8,P>0.05)。100Hz刺激1s,也能部分拮抗刺激引起的幅度降低(n=11,P<0.05)。4.突触活动依赖性释放的内源性腺苷抑制orexin神经元突触后抑制性电流在较低刺激频率下(0.033Hz,1Hz),CPT加入前后,evIPSCs幅度无任何改变。提高刺激频率,2Hz、3Hz、5Hz时,evIPSCs的幅度随着刺激时间(持续600s)而逐渐降低,加入CPT后,这种幅度的降低趋势无显著变化。10Hz,CPT在刺激后期能部分阻断电流幅度的降低(n=9,P<0.05)。100Hz刺激1s,CPT并不能影响刺激引起的幅度降低(n=6,P>0.05)。5.腺苷A1受体拮抗剂增强orexin神经元长时程增强的诱导穿孔膜片钳下,100Hz高频刺激和theta频率刺激诱导orexin神经元上的兴奋性突触后电流(EPSCs)活动出现长时程增加(long term potentiation, LTP)的可塑性,分别增加为119.836% (n=12)和128% (n=12)。高频刺激诱导时加入腺苷A1受体拮抗剂CPT,诱导后洗脱,记录到的EPSCs增加为诱导前的165.9375%(n=12,P<0.05).。提示内源性腺苷可能参与了orexin神经元上突触可塑性的形成。此外,我们还发现,ATP代谢中间产物ADP加至胞外灌流液中,能显著降低evEPSCs的幅度大小。6.PKC、PLC介导的L型钙通道引起的钙内流参与orexin A的升钙效应钙成像研究显示orexin A可引起20%(n=8,8/40,P<0.05)急性分离的前额叶皮层神经元胞内钙增加,且呈剂量依赖性。orexin受体1拮抗剂SB 334867存在情况下,orexin A不能引起胞内钙增加。分别预孵PLC、PKC抑制剂D609和BIS II 1h后,未观察到orexin A的升钙效应。胞外无钙情况下,orexin A不能引起胞内钙增加。预孵钙库抑制剂thapsigargin1h后,orexin A仍能引起胞内钙增加。加入L型钙通道阻断剂nifedipine后,orexin A未能引起钙增加。结果说明,orexn A主要是通过orexin受体1,激活PLC、PKC信号,引起L型钙通道开放,引起胞内钙增加。综上所述,本研究结果表明,腺苷可以突触活动依赖的通过突触前A1受体,抑制orexin神经元上的兴奋性和抑制性突触后活动;内源性腺苷还参与了orexin神经元兴奋性突触传递活动可塑性的形成。Orexin A可以结合orexin受体1,通过PLC、PKC胞内信号,开放L型钙通道,引起前额叶皮层神经元胞内钙增加。