研究背景 酒精性股骨头坏死是骨科常见病,发病率有逐年增加的趋势。该病多见于中青年,且多为双侧发病,未经有效治疗者将发生股骨头塌陷,关节功能损毁,致残率极高,严重影响患者的生活质量。股骨头塌陷患者最终需要进行人工关节置换手术,手术效果对于年轻患者来说尚不确定,早期行人工关节置换将不可避免地行翻修术,经济成本较大,增加患者家庭与经济负担,且并发症多、远期疗效不能肯定,可见该病不仅给病人增加极大痛苦,还引发一系列社会问题。研究发现酒精可诱导骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)内过氧化物酶体增殖子活化受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)基因的高表达,诱导股骨头髓腔内干细胞的成脂分化,促进其向脂肪细胞发展,并因脂类物质沉积而引发股骨头内高压,同时成骨分化能力减弱,最终发生股骨头坏死。抑制或阻断PPARγ基因的表达则抑制其成脂分化,保持成骨分化的特点,减少股骨头坏死的发生率。降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)为一种调节骨组织生长代谢的神经肽基因,可促进骨髓干细胞的增殖能力和成骨活性,与骨代谢和修复密切相关。因此,通过联合调控PPARγ基因和CGRP基因的表达,抑制骨髓干细胞的成脂分化,同时主动增强其成骨分化的能力成为预防酒精性股骨头坏死新的研究方向。研究目的 通过构建能够沉默PPARγ,同时表达CGRP的双基因重组载体,观察联合调控PPARγ基因和CGRP基因的表达对酒精诱导下兔BMSCs成脂、成骨分化能力的影响;采用致敏法与酒精灌胃法制作兔酒精性ONFH模型,将双基因重组载体转染的BMSCs植入动物模型股骨头内,观察其对酒精性股骨头坏死的预防效果,对预防股骨头坏死的进一步研究提供新的实验基础。本研究分为以下三个部分:第一部分:沉默PPARγ表达CGRP基因重组载体的构建与鉴定方法 (1)发卡样si RNA(sh RNA)寡核苷酸链的设计与合成:按照si RNA片段的设计原则,依据Gen Bank中PPARγ的基因序列,筛选并合成合成2条PPARγsi RNA寡核苷酸链,3’和5’端分别加入Bam HⅠ和HindⅢ的酶切残基,并在设计时改变Bam HⅠ酶切位点的一个碱基。(2)兔CGRP基因完整ORF克隆:前期得到兔CGRP基因完整ORF克隆,设计其两端带Mlu I酶切位点,与TGFP融合蛋白表达单元间用一段柔性链连接。(3)重组载体的构建:发卡样si RNA寡核苷酸靶序列退火后克隆入线性化p GFP-V-RS载体,得到沉默PPARγ的沉默载体p GFP-V-RS-si PPARγ;CGRP基因ORF c DNA纯化后与线性化p GFP-V-RS载体连接,得到表达CGRP的表达载体p GFP-V-RS-ex CGRP;CGRP ORF c DNA片段克隆入沉默载体p GFP-V-RS-si PPARγ,得到沉默PPARγ、表达CGRP双基因载体p GFP-V-RS-si PPARγ-ex CGRP。结果 经酶切和DNA测序鉴定正确,三种重组载体构建成功,为进一步观察双基因重组载体对酒精诱导下BMSCs成脂、成骨分化的影响提供实验基础。第二部分:联合调控PPARγ及CGRP基因表达对酒精诱导兔骨髓间充质干细胞分化的影响方法 (1)密度梯度离心法获取兔BMSCs,流式细胞仪行表面抗原CD29,CD34、CD44、CD45、CD105鉴定。(2)应用BTX ECM 2001电转仪系统将重组载体分别电转入BMSCs中,并在需要酒精诱导的各组中加入酒精,终浓度均保持在0.09mol/L,同时设立对照组。MTT法检测各组细胞增殖情况。细胞培养7天、14天时,Taq Man RT-PCR和Western blot检测PPARγ、CGRP、Runx2、osteocalcin m RNA及蛋白的表达。细胞培养14天检测各组细胞内甘油三酯含量、碱性磷酸酶(ALP)活性、培养基中骨钙素含量、层粘连蛋白含量、I型胶原含量,并行ALP染色。细胞培养21天,行油红“O”脂肪染色。结果 (1)流式细胞仪检测表面标志物结果显示,BMSCs表达CD29、CD44、CD105,阳性率分别为99.86%,99.34%,99.65%;CD34、CD45呈阴性,阳性率分别为1.27%,1.45%。得到高纯度的BMSCs。(2)酒精诱导下,转染沉默载体p GFP-V-RS-si PPARγ的BMSCs组中,细胞增殖曲线稍低于正常组,无显著性变化(P>0.05);PPARγ、Runx2和Osteocalcin m RNA及蛋白的表达与正常组中接近,差异无统计学意义(P>0.05);细胞中甘油三酯含量、ALP活性、培养基中骨钙素含量、层粘连蛋白含量、I型胶原含量与正常组接近,差异无统计学意义(P>0.05)。实验第14天时,ALP染色结果显示,部分细胞胞浆染色为蓝/紫色,与Normal组接近。实验第21天,细胞中没有脂滴发现或极少发现,油红“O”脂肪染色结果显示,细胞中极少有橘红色脂滴发现。(3)转染表达载体pGFP-V-RS-exCGRP的BMSCs组中,细胞增殖曲线稍低于Normal组,无显著性变化(P>0.05);能稳定表达CGRP m RNA及蛋白;PPARγm RNA及蛋白的表达、细胞中甘油三酯含量高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05);Runx2和Osteocalcin m RNA及蛋白的表达、细胞中ALP活性、培养基中骨钙素含量、层粘连蛋白含量、I型胶原含量稍低于正常组,差异无统计学意义(P>0.05)。实验第14天时,ALP染色结果显示,部分细胞胞浆染色为蓝/紫色,与Normal组接近。实验第21天,细胞中可以见到大小不一的圆形脂滴,表现为折光较强的圆形黑色颗粒环,油红“O”脂肪染色结果显示,细胞中可见大量橘红色脂滴形成。(4)转染双基因载体p GFP-V-RS-si PPARγ-ex CGRP的BMSCs组中,细胞增殖曲线与正常组基本一致,无显著性变化(P>0.05)。能稳定表达CGRP m RNA及蛋白;PPARγm RNA、蛋白的表达及细胞内甘油三酯的含量得到有效抑制,与正常组相比,差异无统计学意义(P>0.05);Runx2和Osteocalcin m RNA及蛋白的表达量、ALP活性、培养基中骨钙素含量、层粘连蛋白含量、I型胶原含量均高于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验第14天时,ALP染色结果显示,大量细胞胞浆染色为蓝/紫色,较正常组多。实验第21天,细胞中没有脂滴发现或极少发现,油红“O”脂肪染色结果显示,细胞中极少有橘红色脂滴发现。第三部分:联合调控PPARγ及CGRP基因表达预防兔酒精性ONFH的动物实验研究方法 (1)动物模型的制作:取健康新西兰大耳白兔80只,随机平均分组为5组,每组16只。按10ml/kg剂量经兔耳缘静脉行马血清注射,3周后再次注射马血清致敏,剂量同前。2周后10ml/(kg?d)的烈性白酒(体积分数为46%的乙醇)灌胃,此时作为实验第0天,并于实验的第1、3、6周的第一天,用特制骨髓穿刺针在股骨头颈交界处向一侧股骨头内钻约0.5cm的针孔,微量注射器取转染有重组载体的BMSCs 25μl随机注入实验动物一侧股骨头内,骨蜡堵闭穿刺孔道。分别于实验的第4、8周末分批处死实验动物。(2)实验分组:1、实验组(S组):马血清致敏完成后烈性白酒10ml/(kg?d)灌胃,并向一侧股骨头内注射转染有双基因载体p GFP-V-RS-si PPARγ-ex CGRP的BMSCs。2、空载体组(Con组):马血清致敏完成后烈性白酒10ml/(kg?d)灌胃,并向一侧股骨头内注射转染有空载体p GFP-V-RS的BMSCs。3、模型组(M组):马血清致敏完成后烈性白酒10ml/(kg?d)灌胃。4、致敏组(H组):仅行马血清致敏。(5)空白对照组(N组):空白对照。(3)组织形态学的观察:取出股骨头并沿冠状面将其剖开,行苏丹Ⅲ脂肪染色及HE染色,分别对以下指标进行检测:1、骨坏死发生率2、骨小梁面积分数3、空骨陷窝计数4、最大脂肪细胞平均直径。(4)成脂及成骨分化相关基因的检测:Taq Man Real Time-PCR检测PPARγ、CGRP、Runx2、osteocalcin m RNA;Western blot检测PPARγ、CGRP、Runx2、osteocalcin蛋白。结果 (1)实验动物股骨头组织形态学变化:酒精灌胃8w时,M组和Con组的骨小梁变细,稀疏、中断、排列紊乱,骨小梁面积明显减少;股骨头软骨下区骨髓内的脂肪组织明显增多,脂肪细胞增大,有的融合成泡,造血组织明显减少,桔红色的脂质充满软骨下区的骨细胞及骨髓腔内。这些病理变化在N组、H组和S组中并未发现。(2)实验第4周时M组和Con组的空骨陷窝计数较N组增加,差异有统计学意义(P<0.05);H组和S组中的空骨陷窝计数与N组中接近,差异无统计学意义(P>0.05)。实验第8周时,M组和Con组中最大脂肪细胞平均直径、空骨陷窝计数较N组明显增加,骨小梁面积分数较N组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);S组及H组中最大脂肪细胞平均直径、空骨陷窝计数以及骨小梁面积分数与N组相比无明显差异(P>0.05)。(3)PPARγ、CGRP、Runx2、Osteocalcin m RNA和蛋白表达检测结果:实验第4、8周,M组与Con组股骨头骨髓细胞内PPARγm RNA和蛋白呈高表达,与N组差异有统计学意义(P<0.05),CGRP、Runx2及osteocalcin m RNA和蛋白呈低表达,与N组相比差异有统计学意义(P<0.05)。S组中PPARγm RNA和蛋白表达量与N组接近,差异无统计学意义(P>0.05),CGRP、Runx2及osteocalcin m RNA和蛋白呈高表达,与N组相比差异有统计学意义(P<0.05);H组中PPARγ、CGRP、Runx2及osteocalcin m RNA和蛋白表达量与N组接近,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 (1)成功构建三种调控PPARγ和CGRP基因的重组载体:能够沉默PPARγ基因的沉默载体p GFP-V-RS-si PPARγ;能够表达CGRP基因的表达载体p GFP-V-RS-ex CGRP;能够沉默PPARγ,同时表达CGRP的双基因载体p GFP-V-RS-si PPARγ-ex CGRP,经酶切鉴定和DNA测序完全正确。(2)沉默PPARγ表达CGRP的双基因重组载体能有效阻断酒精诱导的BMSCs内PPARγm RNA和蛋白的表达,抑制细胞的成脂分化,同时增加了BMSCs的成骨相关基因及蛋白的表达,增强了其成骨分化的能力。(3)通过联合调控PPARγ及CGRP基因的表达,可显著减少酒精诱导的兔股骨头内脂肪物质的堆积,同时增强了股骨头内BMSCs的成骨分化能力,促进骨组织的修复和重建,有效预防了酒精性股骨头坏死的发生。(4)本实验利用靶向PPARγsi RNA和CGRP基因共同构建双基因重组载体,并转染入BMSCs,通过阻断PPARγ基因,高效阻止细胞成脂分化,同时上调其CGRP表达,直接、主动的促进成骨分化,发挥联合抑制成脂与促进成骨的双重作用,从发病机制的初始关键环节上更高效地预防酒精性ONFH发生。