目的(1)明确ERα在人肺癌组织和A/J小鼠肺癌组织中的表现;(2)证明ERα和CYP1B1参与NNK诱导的肺癌发生;(3)探讨ERα促进NNK诱导肺癌发生的分子机制。方法首先:收集30例肺癌患者术后肿瘤和非肿瘤组织标本,用福尔马林固定、石蜡包埋、切片,通过免疫组织化学染色观察人肺组织中ERα的表达情况,对比肺癌患者正常肺组织和肿瘤组织中ERα蛋白表达情况。其次:利用单剂量NNK (100mg/kg)腹腔注射给药的方式建立A/J小鼠肺癌模型,采用HE染色观察该过程中小鼠肺肿瘤的生长情况,利用免疫组织化学染色对比NNK诱导组小鼠和对照组小鼠肺组织中ERα的表达,通过Western blot、real time-PCR分析,对比肺组织中ERα的蛋白及mRNA水平。简要步骤如下:将160只6周龄清洁级A/J小鼠随机分为2组,每组80只,每笼10只,分笼饲养。实验组通过腹腔注射给予单剂量NNK (生理盐水溶解);对照组仅给予同等体积生理盐水。于NNK处理后第26周开始处死小鼠,每4周1次,每次10只,直至实验结束。取小鼠肺组织,将左肺浸泡于福尔马林溶液中固定、石蜡包埋、切片,制成5 μm厚切片用于免疫组织化学染色和HE染色;右肺保存于-80℃待提取核蛋白、总蛋白和总RNA,用于进行Western blot、real time-PCR和基因芯片等分析。第三:利用Western blot检测NNK处理组小鼠肺组织中CYP1B1的表达变化,观察其与ERα表达改变的相似度。通过基因芯片技术寻找在NNK诱导小鼠肺癌发生过程中与ERα、CYP1B1有关的信息,包括信号通路、基因网络等。利用这些信息判定ERα和CYP1B1是否参与NNK诱导A/J小鼠肺癌的发生。最后:利用人非小细胞肺癌细胞株NCI-H23和NCI-H460探讨ERα、CYP1B1在NNK诱导肺癌发生中的作用及分子机制。(a)细胞培养:2株细胞均采用DMEM+10%FBS培养基,于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中静置培养。根据实验具体内容采取不同分组及处理,主要干预因子包括NNK、U0126和siRNA。(b)通过Western blot分析和免疫荧光染色检验NNK处理后的细胞中CYP1B1、ERα蛋白表达变化,观察其表现是否与NNK诱导的小鼠组织一致。(c)利用流式细胞术观察ERα siRNA和CYP1B1 siRNA干预后细胞的凋亡情况,判定ERα、CYP1B1在NNK促进肿瘤细胞增殖中的作用。(d)通过Western blot分析,观察NNK诱导及siRNA干扰双重作用下细胞中CYP1B1、ERα的蛋白表达变化,判断二者的调控关系。(e)采用Western blot分析检测RAS/ERK/AP1信号通路相关蛋白在NNK诱导下的表达情况,观察该信号通路是否参与NNK诱导的肺癌发生。检测的蛋白包括:ERK、p-ERK、c-Fos、c-Jun、pdcd4、spry1、spry2和btg2。(f)利用Western blot分析检测ERK特异性抑制剂(U0126)处理后细胞中相关蛋白的表达情况,验证RAS/ERK/AP1信号通路参与NNK诱导肺癌发生。检测的蛋白同(e)。同时,观察ERα、CYP1B1、Bax、Bcl-2蛋白表达改变,进一步确认ERα CYP1B1在NNK促进肿瘤细胞增殖中的作用。(g)通过Western blot分析,观察CYP1B1siRNA、ERα siRNA处理后RAS/ERK/AP1信号通路相关蛋白及抗凋亡相关蛋白的表达,分析ERα促进NNK诱导肺癌发生是否需要CYP1B1和ERK的活化。(h)画出可能的调控图。结果(1)从免疫组织化学染色结果看,人肺癌组织中ERα蛋白表达较癌旁正常组织显著升高,且主要集中于细胞核;肿瘤组织中ERα表达平均分为3.5分,ERα表达阳性的细胞占41%-60%。(2) HE染色结果显示,随着NNK作用时间延长小鼠肺组织中肿瘤细胞比例增加,最后形成大面积的瘤体;免疫组织化学染色显示,NNK处理组的ERα表达明显高于对照组,且主要集中于细胞核中,这与在人肺癌组织中观察到的现象一致,并且第26周至第54周肿瘤组织中ERα表达平均分为4.5分,阳性细胞比例占80%以上。Western blot结果显示,与正常对照组相比,随着NNK诱导时间的延长小鼠肿瘤组织中ERα蛋白水平逐渐升高,并一直高于对照组。ERα mRNA水平表达同样随NNK作用时间的延长呈上升趋势,其中第30周、第34周差异显著,具有统计学意义(P＜0.01)。(3)Western blot检测结果显示,在NNK诱导的A/J小鼠肺癌发展过程中,CYP1B1表达明显增加,并且CYP1B1表达增加的时间和趋势部分与ERα变化重叠。基因水平检测显示,NNK诱导第34周时的小鼠肺组织中ERα、CYP1B1编码基因的水平分别较对照组增加8倍、6倍。基因芯片信号通路分析发现,ERα、Cyp1b1共同参与了NNK诱导的小鼠肺癌发生,二者参与的信号通路共8条,其中包括ERK/MAPK信号通路。基因芯片网络分析结果显示,在NNK诱导的肺癌发生发展过程中有3个功能不同的高分值(>15)基因网含有ERα和Cyp1b1,其中ERα和Cyp1b1同时参与药物代谢和小分子生物化学反应。这与二者的生物学功能有关,也可能与NNK代谢有关。(4)(a)体外研究结果显示,NNK处理后的NCI-H23、NCI-H460细胞中ERα、CYP1B1表达上调,其中ERα主要在细胞核中表达,细胞核蛋白中ERα表达增幅较对照组高。该结果与在NNK处理的A/J小鼠肺组织及人肺肿瘤组织中所获得的数据相符。(b)先转染CYP1B1 siRNA和ERα siRNA后加NNK处理的NCI-H23、NCI-H460细胞凋亡率明显上升,转染了CYP1B1 siRNA的NCI-H460细胞凋亡率甚至高达80%。同时,经过转染CYP1B1 siRNA的细胞与没转染的对照组相比NNK导致的ERα上调受到明显抑制,而转染ERαsiRNA的细胞中CYP1B1几乎无变化。说明,抑制CYP1B1表达可以减少ERα,但阻断ERα的表达并不能削弱NNK对CYP1B1的影响。(c)分析ERK/MAPK信号通路相关蛋白表达情况发现,NNK处理后NCI-H23、NCI-H460中p-ERK、c-Fos和c-Jun表达均明显升高,并且c-Fos、c-Jun表达升高与p-ERK基本平行。与c-Fos、c-Jun不同,Ras/ERK/AP1多重负性调节因子pdcd4、spry1、spry2和btg2在NNK作用后总体呈时间依赖的下降趋势。然而,ERK特异性抑制剂(U0126)预处理后再经NNK作用的NCI-H23、NCI-H460相比单纯NNK处理的细胞而言,c-Fos和c-Jun 表达降低,Pdcd4、Spry1、Spry2、Btg2表达升高。(d) Western blot分析发现:与单纯NNK处理组相比,U0126作用后NNK导致的ERα上调受到抑制,ERα表达降低;与ERα相反,U0126阻断ERK后CYP1B1表达与单纯NNK作用组相比有所升高。此结果与siRNA干扰后的结果相似。此外,U0126作用下,抗细胞凋亡蛋白Bcl-2表达降低,促凋亡蛋白Bax表达升高,细胞凋亡能力增加。综上所述,ERα可保护肿瘤细胞防止细胞凋亡,该作用需要通过依赖CYP1B1和ERK活化。结论(1)ERα有助于肺癌的发生发展。(2)ERα、CYP1B1共同参与NNK诱导的肺癌发生。(3)ERα在促进NNK诱导肺癌发生时依赖CYP1B1和ERK活化。(4)抑制CYP1B1、ERK、ERα可以延缓肺癌细胞生长,可作为肺癌治疗的潜在靶点。