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背景与目的: 急性心肌梗死(AMI)是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死,是引起充血性心力衰竭的重要原因。心梗后心肌组织发生凝固性坏死,心肌细胞肿胀,炎性细胞浸润,肌纤维排列紊乱、断裂,心肌细胞核固缩、碎裂或溶解消失,梗死区部分心肌纤维样变性,部分心肌细胞肥厚及细胞核增大。传统意义认为,哺乳动物的心脏是一个终末分化器官,而心肌细胞是一种终末分化的细胞,心梗后心肌细胞没有再生能力而导致心力衰竭的发生。近期有研究显示幼体中存在心肌再生及去分化现象。我们前期研究发现心梗后小鼠心肌组织肌节解聚现象明显,伴随心肌细胞标记物表达下降,心梗梗死区域周边心肌增殖标记物及干细胞标记物则表达增强,并有部分细胞同时表达增殖和心肌的标志物。体外研究中将心梗组织培养后,有大量细胞从组织块迁移出,除去常规认识中的心肌干细胞以外,我们发现有大量较大且为长形或不规则形状的细胞,这些细胞内容物丰富,有类似横纹的结构存在,同时表达心肌细胞及增殖细胞标记物,而假手术组却不能获得这群细胞。将这群爬出的细胞与骨髓细胞共培养,可以刺激骨髓细胞的增殖和分化。本研究的目的是运用免疫荧光染色、RT-PCR、流式细胞术、蛋白芯片检测等方法对心梗发生后小鼠心脏进行分析,从而明确其组织学和细胞学水平在体内及体外发生的改变,初步明确心梗组织迁移出的细胞群的特性。同时通过条件培养基方式,探讨心梗后心肌组织迁移出细胞的功能。 研究方法: 在小鼠心脏的左心耳下缘约2 mm处结扎冠状动脉左前降支,制备心肌梗死模型,切片后行TTC染色,鉴定心梗区域。采用免疫荧光染色及统计学方法,观察心梗7天后小鼠心脏组织中增殖相关蛋白ki67及PH3的表达水平及心肌连接蛋白43(cx-43)和α-横纹肌肌动蛋白单克隆抗体(α-SA)的表达水平,探讨AMI引起心肌组织结构的变化。采用RT-PCR技术分析心梗后心肌组织增殖相关蛋白ki67,PH3,横纹肌蛋白α-SA,α-actinin及连接蛋白cx-43,转录因子nkx2.5,肌细胞增强因子mef2,心肌肌钙蛋白cTNT,干细胞标记物flk-1的表达,探讨心梗后相对于假手术小鼠及乳鼠心肌细胞增殖情况及干细胞标记物的表达差异。将心梗小鼠及假手术对照小鼠心脏组织进行体外培养,观察细胞生长类型。探讨AMI引起心肌细胞体外的改变。对心梗心肌组织培养后获得的条件培养基与小鼠骨髓c-kit+细胞共培养,观察心梗后心肌组织迁移出的这群细胞的功能。并通过蛋白质芯片对心梗后心肌组织迁移出细胞的培养上清进行分析,从而对这群细胞实施功能的机制进行初步探讨。 研究结果: 在心梗3天后,处死心梗小鼠,取出心脏,切片后行TTC染色,可见心梗区域被染成白色提示小鼠模型构建成功。将心梗组织进行免疫荧光染色,发现心梗后,心梗部位周边c-kit阳性细胞增多,ki67和PH3表达增多,α-SA和cx43表达减少,有统计学差异(P<0.05);同时出现α-SA和ki67双阳性细胞及α-SA和PH3双阳性细胞增多。心梗组织块培养后有大量细胞从组织块迁移出,包括小且圆亮的细胞及大且长形或不规则的细胞生长,小细胞提示有心肌干细胞的大量生长,而大且长形或不规则的细胞内容物丰富,有类似横纹的结构存在,通过免疫荧光染色,ki67和α-SA双染,提示该类细胞既有心肌细胞标记物的表达,又有细胞增殖现象。PCR分析发现心梗后小鼠心肌组织相对于假手术小鼠心肌组织cTnct、α-actinin、nkx2.5、mef2、α-SA、GATA4表达降低,有统计学差异(P<0.05);ki67、flk-1表达增高,有统计学差异(P<0.05);scl-1没有明显差异,无统计学意义。心梗后小鼠心肌组织相对于乳鼠心肌组织nkx2.5、GATA4、scl-1表达降低,有统计学差异(P<0.05);α-actinin、mef2、α-SA、flk-1表达增高,有统计学差异(P<0.05);ki67、cTncT无明显差异,无统计学意义。增殖曲线提示心梗心肌组织培养上清相对于假手术心肌组织培养上清更能够促进c-kit+细胞增殖。将IMDM、假手术心肌组织培养上清及心梗心肌组织培养上清与骨髓细胞条件培养基培养后,IMDM组随着时间的迁移,Nkx2.5、mef2、GATA4、flk-1、Sca-1、SSEA表达逐渐减少;假手术心肌培养上清相对于IMDM组基本能维持这些标志物的表达,心梗组织培养上清的Nkx2.5、mef2、GATA4、flk-1、Sca-1、SSEA的表达随着时间的推移表达逐渐增高,提示心梗心肌组织培养上清能够刺激骨髓细胞心肌分化。对心梗心肌组织培养上清和假手术心肌组织培养上清进行蛋白芯片分析,心梗上清CXCL16、IGF-BP-6、IL6、PF-4、sTNF RI、sTNF RII、VEGF、Fg-RIIB、IGF-1、MDC、Pro-MMP-9等生长因子以及一些炎症相关的因子的表达均明显高于正常上清组,提示心梗心肌组织培养上清刺激骨髓c-kit+干细胞增殖和心肌分化主要是依靠这些因子的作用。 结论: 心梗后小鼠心肌组织肌节解聚现象明显,伴随心肌细胞标记物表达下降,心梗梗死区域周边心肌增殖标记物及干细胞标记物则表达增强,并有部分细胞同时表达增殖和心肌的标志物。心梗小鼠心肌组织培养后,发现除去常规认识中的心肌干细胞以外,我们发现有大量较大且为长形或不规则形状的细胞,这些细胞内容物丰富,有类似横纹的结构存在,同时表达心肌细胞及增殖细胞标记物。而假手术小鼠心肌组织中只有成纤维类细胞爬出。因此我们推论这类细胞为假定的去分化的心肌细胞。用心梗心肌组织培养上清与骨髓细胞共培养,我们发现心梗的上清更能够刺激骨髓细胞的增殖。心梗心肌组织培养上清中含有较假手术上清更高的生长因子包括IGF-1、IGFBP2、IGFBP3、IGFBP5、IGFBP6、血管内皮因子VEGF等及炎症相关因子的表达。提示心梗心肌组织培养上清刺激骨髓c-kit+干细胞增殖和心肌分化主要是依靠这些因子的作用。