脊髓损伤可以造成病灶区域大量神经元受损或死亡[1,2]。以往的研究采用药物，手术等治疗方法，效果均不太理想[3-5]。目前，应用干细胞的方法治疗神经损伤被广泛应用于各项研究[6-8]。在各种类型的干细胞中，ADSCs以其来源丰富、取材容易、分化能力强等优点受到越来越多的重视[9,10]。但因其自发向神经方向分化的能力较低，因此，寻找一种能够促进脂肪干细胞向神经方向分化的方法，用以治疗神经损伤，将具有重大意义。Nurr-1是孤儿核受体转录因子超家族的一员，能影响胚胎发育和细胞分化，尤其对中脑多巴胺能神经元的发育和存活有着重要的意义，能促进其发育、成熟、迁移、分化[11-13]。研究表明，Nurr-1基因在多巴胺能神经元发育分化过程中起关键作用，而这种作用与细胞外调节激酶信号通路有关[14]。实验证实，在胚胎前体细胞中过表达Nurr-1基因能促进其向神经元方向分化，并抑制其向神经胶质细胞方向分化[15]。此外，对骨髓干细胞进行Nurr-1基因转染，也能促进其向神经方向分化[16]。综上所述，Nurr-1基因具有促进胚胎前体细胞与BMSCs的神经分化作用，但Nurr-1基因对ADSCs向神经分化的作用尚未有文献报道。神经细胞是电兴奋细胞[17]，有研究证实电刺激能促进神经分化早期中轴突的生长[18,19]。近年来，电刺激对干细胞分化的影响受到越来越多科学家的重视。研究发现，当电刺激强度为10V时，能促进胚胎干细胞向神经方向分化[20]，同时电刺激对骨髓干细胞也有类似的促神经分化作用[16]。这些研究表明电刺激在干细胞的神经分化过程中起着重要的作用。最新研究表明，低频交流电能够提高脂肪干细胞胞浆内的钙离子浓度[21]，但电刺激对脂肪干细胞向神经方向分化的作用鲜有研究。有文献证实，适宜的电刺激能促进嗅鞘细胞和雪旺细胞的增殖活性[22,23]，但电刺激对脂肪干细胞的增殖，凋亡等活性影响尚未研究。本课题主要研究电刺激与Nurr-1基因对脂肪干细胞的神经分化的影响，为脂肪干细胞的神经分化提供新的思路。实验一Nurr-1基因转染对脂肪干细胞神经分化的影响目的研究孤儿核受体相关基因1（Nurr-1）对脂肪干细胞（adipose tissue-derived stemcells，ADSC）向神经元方向分化的作用。方法采用贴壁培养法分离培养ADSCs，对第三代细胞进行流式细胞CD29、CD44、CD45、CD90的分子鉴定与成骨和成脂诱导分化鉴定；采用慢病毒作为载体，将Nurrr-1基因转染进脂肪干细胞，使其得到稳定表达，经培养后对细胞进行神经特异性标志物MAP-2，β-tubulin的免疫荧光染色和蛋白检测，同时，对MAP-2、β-tubulin、NF-200进行基因层面的检测，用以评估其向神经方向分化的能力，并检测其分化率。结果流式细胞术结果显示，经过培养三代的细胞的CD29，CD44表达均在90%以上，CD45，CD90表达均低于1.5%，经过诱导后，对其进行油红O、茜素红S染色，结果发现两组均呈阳性，镜下分别观察到脂滴和钙结节形成。表明所培养的细胞为脂肪干细胞；慢病毒转染Nurr-1基因后，免疫荧光染色检测MAP-2，β-tubulin的免疫荧光强度显著增加。蛋白检测也证实在Nurr-1转染组，MAP-2，β-tubulin的蛋白表达量得到明显提升；RT-PCR结果显示Nurr-1转染的脂肪干细胞中MAP-2、β-tubulin、NF-200的表达量显著提高。结论本实验采用的方法能培养出纯度很高的脂肪干细胞；Nurr-1基因转染脂肪干细胞，能促进其向神经方向分化。实验二电刺激对脂肪干细胞神经分化的影响目的研究了不同强度下的电刺激作用于脂肪干细胞，对其增殖，凋亡及向神经方向分化的影响作用，同时筛选出最佳的电刺激强度。方法实验分为0、0.5、1.0、3.0、5.0V/cm五组；对实验各组进行相应的电刺激后，对各组细胞进行流式凋亡检测、CCK-8活性检测，用以筛选最适宜脂肪干细胞的刺激强度；对电刺激后的实验各组细胞进行神经特异性标志物MAP-2， β-tubulin的免疫荧光检测，蛋白检测，同时对不同组进行MAP-2，β-tubulin和NF-200的基因检测，用于评估不同电刺激强度下其向神经方向分化的能力。结果流式凋亡结果和CCK-8检测结果表明在1V/cm组电刺激下，没有引起明显的细胞凋亡，而且促进了细胞的增殖。经过免疫荧光染色，蛋白检测，1V/cm组中细胞的MAP-2和β-tubulin的免疫荧光呈阳性表达，同时蛋白表达显著增加；RT-PCR检测显示MAP-2，β-tubulin和NF-200的表达量显著提高。结论强度为1V/cm的电刺激可促进脂肪干细胞的增殖，并促进其向神经方向化，为神经损伤的治疗提供了新的可行方法。实验三电刺激联合Nurr-1基因转染作用于脂肪干细胞，对脂肪干细胞神经分化的影响目的将孤儿核受体相关基因1（Nurr-1）和电刺激联合作用于脂肪干细胞，观察这种方法对ADSCs向神经元方向分化的潜在作用。方法将实验分为四组：对照组、电刺激组、Nurr-1基因转染组、电刺激联合Nurr-1基因转染组。应用神经特异性标志物MAP-2，β-tubulin的免疫荧光染色评估其向神经方向分化的能力，并测量各组细胞的突起长度（Image-Pro Plus6.0软件）。对MAP-2，β-tubulin进行蛋白定量检测，对MAP-2、β-tubulin、OCT-4、GFAP和NF-200进行基因水平检测，扫描电镜观察实验各组细胞形态。结果免疫荧光结果显示，对照组中MAP-2和β-tubulin几乎没有阳性表达，电刺激组，Nurr-1基因转染组和电刺激联合基因转染组均有有阳性表达，且电刺激联合Nurr-1基因转染组的MAP-2和β-tubulin的阳性率在这三组中表现最高。分别为MAP-2阳性率：22.10±2.01%，β-tubulin阳性率：66.12±5.03%。分别对各组染色细胞进行突起长度测量发现，对照组的长度为11.8±5.3μm，电刺激组长度为74.1±7.8μm，基因转染组突起长度为61.2±7.1μm，电刺激联合基因转染组的突起长度为174±8.7μm。蛋白检测显示，相比对照组，其他各组的MAP-2与β-tubulin蛋白表达均有显著提升；且电刺激联合Nurr-1基因转染组的蛋白表达量与电刺激组和基因转染组相比也有明显升高。基因检测显示，MAP-2，β-tubulin和NF-200的表达在电刺激组，Nurr-1基因转染组，电刺激联合基因转染组均升高，其中电刺激联合Nurr-1基因转染组升高最为显著。OCT-4与GFAP的表达在这三组中均下降，其中电刺激联合Nurr-1基因转染组的表达下降最明显。对实验各组进行扫描电镜观察，发现对照组细胞贴壁，胞质扩散、平铺，呈多边形。电刺激组细胞出现细胞拉长，呈两极或多极状。基因转染组细胞胞质回缩，呈球形，折光性增强。电刺激联合Nurr-1转染组的细胞胞质明显回缩，胞浆变长呈类轴突状，折光性较强。结论运用电刺激联合Nurr-1基因转染的方法作用于脂肪干细胞能进一步促进其向神经方向分化。