论文部分内容阅读
目的：本实验研究通过基因、蛋白水平研究盐酸小檗碱对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7的体外抗炎作用,以及从NF-κB和MAPK信号转导通路和COX-2介导的级联反应来研究其抗炎的分子作用机制,初步探讨盐酸小檗碱的抗炎作用机制。方法：1用0.1μg/mL的LPS刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞,使其发生炎症反应。18h后检测细胞上清液中TNF-a, IL-6炎症因子的表达量来确定炎症模型的构建。2 MTT法检测盐酸小檗碱低、中、高浓度(5、10、15μg/mL)对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞的细胞毒性。3分别给予不同浓度的盐酸小檗碱预作用于巨噬细胞RAW264.7 3 h后,再加入LPS至其终浓度为0.1μg/mL共同作用细胞18 h后收集细胞上清液,分别用ELISA、qPCR方法从蛋白和基因水平检测细胞炎症介质Mincle、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达量。4 Western blot法检测盐酸小檗碱对NF-κB信号通路中的IκB-α磷酸化蛋白(p-IκB-α)、IκB-α总蛋白(IκB-α)、p65磷酸化蛋白(p-p65)、p65总蛋白(p65)表达的影响及MAPK信号通路中的起主要作用的ERK1/2磷酸化蛋白(p-ERK1/2)、 ERK1/2总蛋白(ERK1/2)、JNK1/2磷酸化蛋白(p-JNK1/2)、JNK1/2总蛋白(JNK1/2)、p38磷酸化蛋白(p-p38)、p38总蛋白(p38)表达的影响。5 Western blot法检测盐酸小檗碱对花生四烯酸裂解为前列腺素(PG)过程中的一类重要的限速酶COX-2的作用及用ELISA方法检测盐酸小檗碱对其下游释放的NO, PGE2的作用。结果：1小鼠巨噬细胞RAW264.7被0.1μg/mL LPS诱导后,细胞炎症反应模型成功建立,模型细胞细胞培养上清液中的TNF-α、IL-6炎性因子的表达量明显升高,与正常组比较存在着显著性差异(P<0.01)。2盐酸小檗碱低、中、高浓度(5、10、15μg/mL)对RAW264.7细胞的几乎没有细胞毒性时,与正常组细胞相比较,细胞相对活力均大于90%。3与LPS炎症模型组比较,在蛋白和基因水平,不同浓度的盐酸小檗碱都能够显著性地降低LPS诱导的RAW264.7炎症细胞培养上清液中TNF-αIL-1β和IL-6细胞促炎症因子的表达量和显著性提高LPS诱导巨噬细胞中抗炎因子IL-10的表达,此外还能够在]mRNA上抑制Mincle的表达(P<0.05)。4对盐酸小檗碱抗炎分子作用机制进行了研究,研究结果显示盐酸小檗碱能够显著性地降低NF-κB信号通路中p65蛋白磷酸化水平、IκB-α磷酸化水平,提高IκB-α总蛋白表达水平(P<0.01)；显著性降低MAPK信号通路中ERK1/2、 JNK1/2蛋白的磷酸化水平,显著性地提高ERK1/2、JNK1/2总蛋白的表达水平(P<0.01)；但对p38蛋白几乎没有作用。5盐酸小檗碱能够显著性降低LPS诱导巨噬细胞中COX-2蛋白、NO、 PGE2的表达,且呈剂量关系(P<0.01)。结论：在体外用0.1μg/mL的LPS成功构建了巨噬细胞RAW264.7炎症的反应模型,并且低、中、高不同浓度的盐酸小檗碱都能够显著性地抑制促炎因子的表达量且显著性地提高一些抗炎因子的表达水平,这些结果提示盐酸小檗碱在体外实验中有很好的抗炎作用。进一步对其抗炎的信号通路进行研究结果表明,盐酸小檗碱对MAPK及NF-κB信号转导中的磷酸化蛋白起到了一定程度的抑制作用,能够调节炎症过程中细胞因子的表达和分泌,因此推测其抗炎作用有可能是通过抑制这些分子信号通路的激活来发挥其抗炎作用；此外,盐酸小檗碱还能够在一定程度上抑制细胞内COX-2、NO、PGE2的分泌水平,推测盐酸小檗碱亦可以通过干扰花生四烯酸的裂解催化过程来发挥抗炎作用。