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高羊茅(Festuca arundinacea Schreb)是多年生禾本科羊茅属(Festuca)草本植物,因其抗逆性强、耐践踏、耐粗放管理,被广泛应用于水土保持及绿化工程;冷季型草在夏季有“休眠”现象,这限制了高羊茅在夏季的使用,所以延长高羊茅绿期是重要的育种目标之一。CRISPR/Cas9系统作为一种新兴的基因编辑技术,因其系统构建简单、精准度髙、能同时对多个位点进行定点编辑、成本低等优点成为目前研究的热点。本研究利用Ca(Cl O)2代替升汞消毒剂,优化高羊茅种子消毒方式;再运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建高羊茅Fa SGR基因敲除载体;最后利用农杆菌介导法将该表达载体转入高羊茅愈伤组织内进行遗传表达,并通过测序和实时荧光PCR技术检验转基因植株中SGR基因的突变和表达情况,为CRISPR/Cas9基因编辑技术在高羊茅遗传改良上的运用奠定研究基础,主要结论如下:1)利用Ca(Cl O)2作为消毒剂处理高羊茅种子(升汞消毒剂为对照组),以三种不同的前处理方式与不同浓度Ca(Cl O)2溶液和不同消毒时间相配合,分别对高羊茅种子进行消毒。结果表明前处理方式仅用Ca(Cl O)2搅拌的种子感菌率显著高于其余两种前处理方式;Ca(Cl O)2高浓度处理比低浓度处理的出愈率低;Ca(Cl O)2处理的出愈率和愈伤总数均高于升汞处理;最佳的消毒组合是无菌环境下用Ca(Cl O)2搅拌+3%Ca(Cl O)2浸泡60 min。2)针对高羊茅SGR基因(登录号319430080)CDS区的前两个外显子设计引物,并确定其碱基序列;利用CRISPR/Cas9靶点设计原则来对获得的碱基序列进行靶点设计;利用靶点检测试剂盒对g RNA靶点的DNA进行酶切检测靶点活性,从而降低脱靶率;最终将选择的靶点构建到VK005-05表达载体中,并命名为Fa SGR-Cas9载体,该表达载体携带Kan和Hyg抗性。3)利用冻融法将Fa SGR-Cas9载体转入到农杆菌感受态中,并在含有不同Kan浓度的LB固体培养基上进行划线培养,最终确定农杆菌生长的最佳Kan抗生素浓度为75 mg·L-1;愈伤组织经过农杆菌侵染后,第一轮潮霉素筛选最佳浓度为75 mg·L-1,第二轮筛选最佳浓度为100 mg·L-1;抗性愈伤获得率为6.7%;抗性愈伤分化率为0.5%,其中白化表型和正常表型产生比例约为2:1。4)为了检测获得的转基因植株是否为阳性植株,分别提取7株正常表型的转基因植株和3株白化表型的转基因植的总DNA进行PCR检测,以阳性菌液为阳性对照,以野生型植株和水为阴性对照;PCR检测结果表明:只有1个正常表型的转基因苗中未扩增出目的条带,其余的样品均含有目的条带。将9个有目的条带的样品进行测序,结果显示虽然载体成功转入植株中,但靶点序列碱基未产生改变。5)为了验证SGR基因在黑暗条件下对野生型高羊茅植株叶绿素降解的诱导作用以及比较野生型和转基因植株中SGR基因的含量,选择完整,形态较好的高羊茅野生型叶片进行离体黑暗诱导,分别选取第0,3,6,9 d的叶片提取RNA并转录为c DNA进行实时荧光PCR,结果表明离体黑暗处理6 d的叶片的SGR基因含量最高。6)虽然转基因植株的靶点碱基并未产生改变,但是为了获得SGR基因在转基因植株中的表达量,提取阳性植株的RNA,转录为c DNA进行q RT-PCR,并以野生型的高羊茅叶片为对照;结果表明:SGR基因的表达量在转基因植株中呈下降趋势,说明虽然靶点碱基并未改变,但CRISPR/Cas9载体系统对SGR基因的表达有抑制作用。