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研究背景和目的胃癌(Gastric Cancer,GC)是我国常见恶性肿瘤,尽管近年来在胃癌的诊断和治疗上取得一定进步,但我国GC的发病率与死亡率仍位居前列。从分子层面上探究胃癌发生、发展将有助于寻找到新的治疗突破点。EphB6是酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)家族中一种缺乏酪氨酸激酶活性的特殊型受体。目前国内外大量研究提示EphB6在大部分肿瘤中呈现低表达,可能发挥着抑癌基因功能。但是EphB6在胃癌中的研究尚少,本课题前期通过对胃癌患者外周血样本ctDNA高通量测序,发现多例EphB6基因高频突变。基于前期研究,我们以胃癌为研究对象,将EphB6作为目的基因,明确EphB6在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达,探究可能影响EphB6基因表达的机制;构建EphB6稳定过表达的胃癌细胞株,观察其对胃癌细胞增殖、侵袭转移的影响,并初步探索相关分子机制。研究方法1.运用公共数据库生物信息网站及免疫组化技术研究胃癌组织及对应的癌旁正常组织EphB6表达情况并进一步分析EphB6蛋白表达水平与患者临床病理参数的关系。2.应用RT-PCR、Westernblot技术检测正常胃上皮细胞GES-1和5种胃癌细胞株(BGC823、HGC-27、MGC803、AGS、SGC7901)中EphB6的表达情况并且运用特异性甲基化PCR(MSP)检测6株实验株甲基化的情况。3.利用RT-PCR、Westernblot技术、MSP检测去甲基化药物对胃癌细胞株EphB6表达情况及甲基化情况影响。4.构建人EphB6基因慢病毒过表达载体并进行病毒包装与鉴定,将慢病毒体外转染EphB6相对低表达的人胃癌细胞株,利用Puromycin筛选出稳定过表达实验株,采用RT-PCR、Westernblot方法验证稳定过表达EphB6的实验株,通过CCK-8增殖实验、Transwell侵袭实验分别探究EphB6过表达前后细胞增殖、侵袭转移生物学行为的变化;运用Westernblot检测磷酸化ERK蛋白,进一步探索其可能的分子机制。研究结果1.公共数据库生物信息GEPIA网站分析结果与免疫组化检测胃癌组织标本均显示癌旁组织EphB6的表达高于胃癌组织中EphB6的表达;进一步将免疫组化检测结果与合临床数据结合分析,发现EphB6蛋白表达下调与胃癌分化程度(P=0.042<0.05)、有无脉管癌栓(P=0.013<0.05)存在相关性,但与性别(P=0.486)、年龄(P=0.323)、肿瘤部位(P=0.495)、是否有淋巴结转移(P=1.00)、是否神经侵犯(P=0.079)以及临床分期(P=0.734)均无显著相关(P>0.05)。2.采用RT-PCR、Westernblot、MSP检测6株实验细胞株EphB6在mRNA和蛋白水平表达及其甲基化状态。RT-PCR检测EphB6 mRNA表达,结果显示:HGC-27、SGC7901、BGC823、MGC803 4株胃癌细胞株较正常胃上皮细胞呈现低表达,AGS胃癌细胞株较正常胃上皮细胞呈现高表达;Westernblot检测EphB6蛋白表达结果显示:HGC-27、BGC823、MGC803 EphB6蛋白表达较正常胃上皮细胞低(P<0.05),AGS、SGC7901与正常胃上皮相比并无明显差异(P>0.05)。MSP检测甲基化结果显示:AGS为完全非甲基化状态,GES-1、HGC-27为部分甲基化状态,SGC7901、BGC823、MGC803为完全甲基化状态。采用以上3种实验方法最终筛选出EphB6最低表达、高甲基化状态的BGC823胃癌细胞株作为后续实验株。3.采用RT-PCR、Westernblot、MSP检测不同浓度去甲基化药物作用于BGC823胃癌细胞株后,EphB6在mRNA和蛋白的表达水平及其甲基化状态,结果显示:EphB6mRNA、蛋白表达均不同程度的提高(P<0.05),且随着药物浓度增加EphB6表达升高,与浓度呈正相关;EphB6甲基化状态随着药物增加降低,降低程度与浓度呈正相关性。4.构建稳定过表达EphB6基因的BGC823实验细胞株,运用RT-PCR、Westernblot检测,结果显示:实验株EphB6 mRNA和蛋白的表达水平均较空载体对照组明显升高(P<0.05)。进一步采用CCK-8增殖实验检测细胞增殖状况差异,结果显示:实验组较空载体对照组组增长缓慢、过表达EphB6的BGC823实验组增长明显受到抑制,在48h、72h出现明显统计学差异(P<0.05)。采用Transwell实验检测细胞侵袭状况差异,结果显示:过表达EphB6 BGC823实验组的侵袭细胞数较其对照组明显减少(P<0.001)。采用Westernblot检测磷酸化ERK表达水平差异,结果显示:过表达EphB6BGC823实验组磷酸化ERK蛋白较对照组明显升高(P<0.001)。结论1.EphB6在胃癌组织中表达低于癌旁正常组织,并且EphB6蛋白表达与脉管癌栓、胃癌分化程度密切相关,提示EphB6在胃癌中可能也是扮演抑癌基因的角色。EphB6蛋白表达水平有可能是影响胃癌发生、发展重要的参考指标。2.EphB6启动子的甲基化状态通过下调该基因的转录水平进而降低其在胃癌中的表达,它可能是调控EphB6蛋白表达的重要机制之一。3.去甲基化药物5-Aza-CdR通过逆转EphB6基因启动子区甲基化状态,上调EphB6蛋白的表达,且蛋白表达上调的程度与浓度呈正相关。4.EphB6过表达可显著抑制BGC823人胃癌细胞的增殖、侵袭转移。EphB6可能通过活化P-ERK来改变人胃癌细胞株的生物学行为。