大黄作为我国大宗药材之一,其主要生物活性成分为游离蒽醌类化合物,是典型的蒽醌类天然产物原料。目前,大黄中游离蒽醌类天然产物的提取方法有氯仿提取法、乙醇提取法、碱提法等,在提取过程中都会使用到氯仿等有毒性挥发溶剂,同时在后期分离纯化过程中还会使用到丙酮、吡啶和强酸强碱等有毒性溶剂,操作过程复杂,且对环境会造成严重污染,限制了大黄中游离蒽醌类天然产物的产业化生产。因此,本研究采用新型、绿色环保的低共熔溶剂作为大黄中五种游离蒽醌类化合物的提取溶剂,以传统有机溶剂氯仿为对照,通过主成分分析法从13种低共熔溶剂中筛选出适合于提取大黄中五种游离蒽醌类化合物的低共熔溶剂,并考察了最适低共熔溶剂组分摩尔比、含水量对五种游离蒽醌类化合物提取率的影响,同时采用Box-Behnken(BBD)试验设计对其提取工艺进行了优化,最后采用大孔吸附树脂法对低共熔溶剂提取液中五种游离蒽醌类化合物进行富集分离纯化,为大黄中游离蒽醌类化合物的提取及分离纯化提供一种新的方法。主要研究结果如下:1 通过对检测波长、流动相、梯度洗脱程序、柱温及流速等色谱条件进行优化,建立了同时测定大黄低共熔溶剂提取液中五种游离蒽醌类化合物的HPLC-UV分析检测方法:色谱柱:Agilent Eclipse XDB-Cl8(4.6×250mm,5μm),流动相体系:0.10%磷酸水溶液(A)-甲醇(B),流速:1.0mL/min,梯度洗脱条件:0～15min,70～100%B;15min～20 min,100～70%B;20～25 min,70%B,检测波长 264 nm,柱温 30℃进样量10μL。同时对该方法进行方法学考察,结果表明,该方法线性关系良好(R2≥0.9993);试验重现性高,五种游离蒽醌化合物的峰面积RSD为1.2%～2.4%,其保留时间的RSD为0.4%～0.6%;试验仪器日间及日内精密度高,五种游离蒽醌化合物的峰面积RSD为1.5%～3.9%,保留时间RSD为0.3%～0.9%,符合测定标准;稳定性良好,五种游离蒽醌类化合物标准品峰面积的RSD为1.5%～3.6%,其保留时间的RSD为0.2%～0.8%;五种游离蒽醌类化合物的加标回收率为98.61%～103.46%,相对标准偏差RSD均小于4.1%。因此,表明本研究用此HPLC-UV检测方法测定大黄低共熔溶剂提取液中五种游离蒽醌类化合物是可行的。2 本研究采用新型、绿色环保的低共熔溶剂作为大黄中五种游离蒽醌类化合物的提取溶剂,以传统有机溶剂氯仿为对照,采用主成分分析法从13种低共熔溶剂中筛选出最适于提取大黄中五种游离蒽醌类化合物的低共熔溶剂体系,并考察了最适低共熔溶剂组分摩尔比及含水量对提取率的影响。结果表明,低共熔溶剂体系、组分摩尔比及含水量对五种游离蒽醌类化合物提取率都有影响,其中组分摩尔比对提取率影响差异性不显著,体系及含水量对提取率影响显著,最适低共熔溶剂的最优参数为:体系为乳酸/葡萄糖,组分摩尔比为1:2,含水量为20%。3 通过单因素试验,选取提取时间、提取温度及液固比三个因素为自变量,以总游离蒽醌提取率为因变量,采Box-Behnken(BBD)试验设计对低共熔溶剂提取大黄中五种游离蒽醌类化合物的提取工艺进行优化。结果表明,提取时间、提取温度和液固比在一定范围内对大黄中五种游离蒽醌类化合物提取率均有一定的促进作用。模型确定的最优提取工艺条件为:提取温度为81.42°C,提取时间为1.53 h,液固比为25.51 mL/g,提取率为25.38 mg/g。考虑到试验操作的方便性,确定的最优条件为:提取温度为82℃,提取时间为1.5 h,液固比为26 mL/g。按此最优提取工艺条件进行提取,经3次平行试验测得总游离蒽醌的平均提取率为25.28±0.07 mg/g,模型的实测值与预测值偏差较小,表明该回归模型稳定,可靠,能较好的预测试验提取率。4 分别选取了 DM130、X-5、AB-8和DM301四种大孔吸附树脂对低共熔溶剂中五种游离蒽醌类化合物进行富集分离。结果表明,四种大孔吸附树脂对五种游离蒽醌类化合物都有较好的分离效果,其中DM130型大孔吸附树脂的富集分离作用最好,五种游离蒽醌类化合物的回收率分别为84.08%、79.51%、84.96%、81.83%和78.35%,四种大孔吸附树脂分离效果的优劣次序为:DM130>X-5>AB-8>DM301。