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丁醇是一种重要的C4平台化合物,可以作为有机合成的原材料、中间体或化学品,广泛应用于制药、化工等多种领域,同时研究表明丁醇是一种优于乙醇的生物能源,因此生物丁醇发酵的研究和开发具有十分重要的意义。微生物发酵法生产丁醇因具有对环境友好和不依赖石化原料的特性,已成为国际上的研究热点。全文可分为两部分:
第一部分:基因组改组技术选育丙酮丁醇高产菌
以丙酮丁醇梭菌(C.acetobutylicumCICC8012)为出发菌株,经紫外线与微波联合诱变、亚硝基胍诱变两种方法处理,获得3株用于基因组改组的出发菌株。以可溶性淀粉为唯一碳源,溴甲酚绿作为指示剂,含最低抑制浓度丁醇、2-脱氧-D-葡萄糖、链霉素的筛选平板在选育生长快、产溶剂量高的菌株时被证明是有效的筛选手段。
采用添加10mg/mL青霉素前处理菌株,原生质体制备时以溶菌酶处理th,同时采用水浴灭活和紫外线灭活有利于提高基因组改组的成功率,原生质体融合时采用30%的PEG4000、50mMCa2+融合20min。经两轮基因组改组获得了稳定的高产菌F2-GA。基因组改组菌F2-GA以5.5%葡萄糖为底物发酵72h后,总溶剂产量为22.24g/L(含乙酵2.35g/L,丙酮5.71g/L,丁醇14.15g/L),与出发菌株相比,总溶剂提高了34.28%,发酵效率达到了42.1%,提高了34.5%。
荧光定量PCR分析表明,基因组改组菌F2-GA丁醇代谢途径中关键酶基因的表达量与出发菌株不同。发酵18h(产酸期和产溶剂早期)时,基因组改组菌F2-GA的产酸基因(ask,buk)表达量明显下调,只有出发菌株的一半左右;而产溶剂基因(adc,ctfAB,adhE和bdhB)明显上调。当发酵时间延长到36h时(产溶剂期),与此时出发菌株关键酶基因表达量相比,基因组改组菌F2-GA的产酸基因(ask,buk)的表达量变为明显上调,产溶剂基因(adc,ctfAB,adhE和bdhB)除adc无明显变化外,其余基因均明显上调。
第二部分:发酵法生产丙酮丁醇
发酵法生产丙酮丁醇在环保、节约能源方面有诸多优势,但限制其发展的重要因素之一是原材料价格居高不下。
芭蕉芋为多年生草本植物,主要分布于四川、贵州、云南、广西等西南数省,是集能源、饲料于一体的多功能经济作物。开发了芭蕉芋发酵丙酮丁醇预处理工艺:当芭蕉芋粉碎后按1∶2(W∶V)与1M的硫酸混合,沸水水浴加热60min,然后Ca(OH)2快速中和,糖得率>95%,羟甲基糠醛<0.8g/L,处理液可用于丙酮丁醇发酵。
浮萍是新型能源水生植物,具有生长快、淀粉含量高等优点,可以作为丙酮丁醇发酵生产的原料。结果表明以粉碎的新鲜少根紫萍为培养基(初总糖4.32%),可产生了8.24g/L的丁醇和12.49g/L的总溶剂。
为实现资源最大化利用原则,研究了甘薯燃料乙醇废渣和废水的能源化利用。结果表明甘薯燃料乙醇发酵废液可直接发酵丁醇,甚至比直接使用自来水效果更优。