论文部分内容阅读
IRF家族在鱼类非特异性免疫中发挥重要作用,一直受到人们广泛关注。本研究首次分别对斜带石斑鱼IRF家族的一个基因(IRF-1)进行克隆,并选择其中的一个重要基因:干扰素影响因子1——Interferon regulator factor1(IRF-1)进行了克隆鉴定、诱导表达和初步功能分析,以从分子机制上对斜带石斑鱼的防病和分子疫苗的研制打下基础。
干扰素影响因子1是干扰素家族的第一个成员,在免疫应答、抗病毒、细胞生长调节以及细胞凋亡等生物过程中发挥着重要的作用。
本文对斜带石斑鱼的IRF-1基因进行了克隆,测序及各种特征化研究的研究。以PBS做对照利用polyI:C刺激斜带石斑鱼(Epnephelus coioides),然后采肝脏、头肾、脾脏、肌肉、脑、心脏提取总RNA。根据相近物种IRF-1的保守序列设计引物,PCR得到了保守片段,通过RT-PCR和RACE-PCR,获得了斜带石斑鱼JRF-1基因的cDNA全长,同样的方法获得了IRF-1基因DNA全长。
EcIRF-1基因cDNA全长为1759bp,完整ORF框906bp,编码302个氨基酸,5’非编码区182bp,3’非编码区671bp。EclRF-1基因组由十个外显子和九个内含子组成,约4.3kb。基因5’非翻译区包含一个外显子和一个内含子,3’非翻译区包含一个外显子。EcIRF-1基因cDNA与海鳜(Siniperca chuatsi)同源性最高,为85%。将IRF-1 ORF推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,斜带石斑鱼与海鳜同源性为90%,金头鲷(sparusaurat)88%,乌鳢(Channa argus)86%,大菱鲆(Scophthalmus maximus)82%。利用ORF)芋列,构建原核重组表达质粒。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白成功表达,表达的蛋白约55 KDa。诱导温度在37℃时,重组蛋白主要以包涵体形式存在,但当诱导温度降到30℃的时,重组蛋白中可溶性蛋白量明显增加。
实时定量PCR分析表明,EcIRF-1基因在健康鱼体的各个组织中都有表达,polyI:C和LPS的体外诱导,能够影响EcIRF-1基因在组织中的表达量。
亚细胞定位表明,EcIRF-1蛋白在培养的鱼细胞核中检测到,但并没有类似于其他鱼IRF-1蛋白的动态变化的过程。