【背景】前列腺癌（prostate cancer, PCa）在西方国家是老年男性最常见的恶性肿瘤之一。美国癌症协会估计2012年美国男性将新发癌症病例848170例，其中前列腺癌占居首位（29％）；男性癌症死亡病例301820例，前列腺癌占9％，位居第二位。近年来，在我国随着普遍医疗水平的提高以及社会的老龄化，前列腺癌的发病率也呈现明显上升的趋势，严重影响着我国50岁以上男性的生活质量和预期寿命。预计到2020年，我国前列腺癌的发病率将高达40/10万，年新发病例达35万，与肝癌的发病率相当。前列腺癌已成为世界性的公共健康问题。前列腺癌临床上可分为局限性前列腺癌和晚期前列腺癌两种，其治疗方法也根据此两种类型划分为观察监测、根治性手术及雄激素剥夺治疗。对于不能行手术治疗的晚期前列腺癌患者，目前标准治疗方法仍是采用激素阻断治疗联合放化疗。这种方法早期一般是有效的，此时称激素依赖性前列腺癌（androgen-dependent prostatecancer, ADPC），其有效率一般可达70％～80%，然而，大多数肿瘤2年内复发并进展为具有高侵袭、增殖等恶性能力更高的激素非依赖性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer, AIPC）。一旦进入此阶段，几乎任何临床治疗方法都疗效甚微，此期患者病情不可遏制的急剧恶化，肿瘤迅速转移侵袭其它器官，最终导致患者死亡。因此，研究前列腺癌细胞在去雄激素环境下生长、增殖、侵袭能力的变化及其机制，可为临床上前列腺癌的诊断及治疗提供新的策略。miRNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类来源内源性染色体上的非编码单链RNA，长度为21～25nt的短序列，通过与靶mRNA3′UTR完全或不完全的互补结合在转录后水平对基因表达进行调控，影响细胞增殖、分化和凋亡，在生命活动中发挥重要作用，并可通过类似癌基因、抑癌基因或其他方式调控肿瘤的发生、发展和转归过程。通过生物信息学预测，人体内有将近30%左右的基因受到miRNA的调节，特别是那些处在信号转导通路上的分子更是miRNA的调节靶基因。最近研究表明一些miRNA在前列腺癌组织中异常表达，miRNA在前列腺癌发生、发展的分子机制中起着重要作用。miRNA的发现和研究为理解基因的表达和功能提供了新的思路，前列腺癌相关的miRNA有望成为临床前列腺癌诊断、治疗和预后判断的重要分子标志物。【目的】针对ADPC和AIPC的病例标本，进行miRNA芯片筛选，建立前列腺癌雄激素阻断治疗后，两个重要阶段的miRNA表达谱数据库，并通过细胞模型进行验证；选取差异表达显著miR-345作为本实验的研究对象，进一步明确miR-345主要参与的调控细胞的生物学功能以及探索miR-345在前列腺癌非雄转化进程中的作用机制，为miR-345成为前列腺癌恶性进展标志物和治疗靶点奠定理论基础。【方法】1、针对ADPC和AIPC晚期前列腺癌原位标本进行miRNA表达谱分析，筛选差异表达miRNA。利用雄激素依赖性前列腺癌细胞系LNCaP在体外去雄诱导下长期培养建立雄激素非依赖性前列腺癌细胞亚系LNCaP-AI，行LNCaP及LNCaP-AI细胞系RT-PCR方法验证差异表达miRNA，同时选取差异表达显著miR-345作为本实验的研究对象，并测定其在前列腺各细胞系中的不同表达量，明确后续工作有研究价值。2、进行miR-345细胞功能学实验，通过转染人工合成的miR-345的模拟物和反义体，在LNCaP及LNCaP-AI细胞中过表达或敲除miR-345，检测对细胞生长增殖、迁移、侵袭等功能的影响。3、进行miR-345在前列腺癌细胞中作用机制的研究，在LNCaP及LNCaP-AI细胞中过表达或敲除miR-345，检测其对细胞周期、神经内分泌表型及雄激素敏感性的影响，并筛选检测其作用的靶基因。4、 miR-345作为肿瘤标志物在前列腺癌患者中的血清检测。【结果】1、利用组织芯片检测及RT-PCR法验证，ADPC及AIPC标本中差异表达显著的miRNA有7个，其中表达上调的有miR-345，miR-221，miR-663，miR-222，miR-106a，表达下调的有miR-29c，miR-148a。2、 miR-345在人AIPC组织和ADPC组织中差异表达显著；miR-345在前列腺正常上皮细胞RWPE-1中含量最低，在激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-AI中含量最高；激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-AI、PC3、C42中的含量均高于激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP。3、 CCK-8检测结果示：转染miR-345的LNCaP细胞生长增殖能力明显增强，而转染anti-miR-345的LNCaP-AI细胞生长增殖能力则明显减弱。4、划痕实验结果示：转染miR-345的LNCaP细胞划痕间距离明显缩短，而转染anti-miR-345的LNCaP-AI细胞划痕间距离较对照组无明显变化。5、 Transwell侵袭实验结果示：转染miR-345的LNCaP细胞穿过基质胶的细胞数量较对照组无明显变化，而转染anti-miR-345的LNCaP-AI细胞穿过基质胶的细胞数量较对照组也无明显变化。6、流式细胞学检测示：转染miR-345的LNCaP细胞S期数量较对照组明显增加，而转染anti-miR-345的LNCaP-AI细胞S期数量较对照组明显减少。7、转染miR-345的LNCaP细胞去雄培养3天后出现明显神经内分泌样改变，RT-PCR检测细胞NSE表达水平也在去雄培养3天后较对照组明显升高。8、 RT-PCR法检测细胞PSA、AR表达结果示：转染miR-345的LNCaP细胞AR表达无明显变化，但DHT诱导的PSA表达较对照组明显减少；而转染anti-miR-345的LNCaP-AI细胞的AR表达无明显变化，但DHT诱导的PSA表达较对照组明显增加。9、通过生物信息学方法筛选及RT-PCR、Western Blot验证，发现miR-345通过调控CDC25B而影响细胞生长周期。10、收集ADPC及AIPC患者术前全血，利用RT-PCR法检测前列腺癌患者血清miR-345表达水平，发现在AIPC患者中明显增高，且与血清PSA相关。【结论】1、通过基因芯片和细胞模型筛选出明显差异表达miRNA7个，其中表达上调5个：miR-345、miR-221、miR-663、miR-222、miR-106a，表达下调2个：miR-29c、miR-148a。2、 miR-345在人AIPC组织和ADPC组织中差异表达显著，而且miR-345在LNCaP-AI细胞系中的含量明显高于LNCaP、PC3、C42、RWPE-1细胞系，提示miR-345可能参与前列腺癌的发生、发展，尤其在前列腺癌的恶性进展、激素非依赖性转化进程中发挥作用。3、 CCK-8及划痕实验结果示：miR-345能明显促进LNCaP及LNCaP-AI细胞的生长增殖，并增强LNCaP细胞的迁移能力；而且流式细胞学检测发现miR-345能明显增加前列腺癌S期细胞。说明miR-345在前列腺癌恶性进展中起一定促进作用。4、 RT-PCR法检测NSE、PSA以及AR结果示：miR-345能明显促进LNCaP细胞神经内分泌样改变；不影响LNCaP和LNCaP-AI细胞AR受体的表达，但明显影响AR介导的PSA表达，降低LNCaP细胞的雄激素敏感性。提示miR-345参与前列腺癌激素非依赖性转化。5、通过生物信息学方法筛选及RT-PCR、Western Blot验证，发现miR-345通过调控CDC25B而影响细胞生长周期。6、检测前列腺癌患者血清miR-345，发现在AIPC患者中明显升高，且与血清PSA相关，提示miR-345可作为血清肿瘤标志物，将具有侵袭性等恶性潜能的激素非依赖性前列腺癌患者从激素依赖性前列腺癌患者和局限性前列腺癌患者中区分出来。