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由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cubens,Foc)引起的香蕉枯萎病,是一种毁灭性的土传真菌病害,已经对我国乃至世界香蕉产业造成重大影响。香蕉枯萎病菌有4个生理小种,其中热带4号生理小种(Tropicalrace4,TR4)致病力最强、寄主范围最广、危害最为严重,是我国及世界香蕉产业最主要的威胁,研究其重要致病基因及其致病机制对于开展分子育种、研发有效的防控措施具有重要的意义。 前期研究表明一些基因在FocTR4侵染过程中有较高水平表达,说明它们在病原菌致病过程中起重要作用。本项目选择SIX1(Secretedinxylem1)、SIX4以及SGE1(SIXGeneExpression1)开展相关研究,结果如下: 1.SIX1、SIX4和SGE1基因的鉴定全长序列的获得: 从NCBI数据库下载番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici,Fol)的SIX1、SIX4和SGE1基因序列,将之比对到已经测序和组装好的FocTR4菌株II5(VCG01213)基因组序列,获得其相应基因序列,发现SIX1有3个拷贝(FOIG_16556,FOIG_16557和FOIG_16627),SIX4有1个拷贝(FOIG_16632)和SGE1有1个拷贝(FOIG_08835),分别与Fol相关基因存在较高的同源性。 2.SIX1A、SIX4和SGE1基因的敲除及回补实验: 利用本实验室建立的基因敲除技术体系,对上述基因成功进行了干扰,并通过PCR验证以及Southernblot验证,获得它们的敲除突变体以及回补突变体。 3.敲除突变体△FoSIX1A、△FoSIX4及△FoSGE1的形态及致病性鉴定: 敲除突变体△FoSIX1A及△FoSGE1的菌丝几乎不产生色素,△FoSIX4的菌丝色素变成浅红色,说明SIX1A、SIX4和SGE1均能对菌落形态进行调控。通过与对照组比较,△FoSIX4和△FoSGE1的产孢量降低,△FoSIX1A的产孢量升高,说明SIX1A、SIX4以及SGE1的表达变化对FocTR4菌株产孢能力有影响;另外,△FoSIX1A、△FoSIX4及△FoSGE1接种感病香蕉品种巴西蕉后,与野生型菌株II5相比较,其在根系中的生物量均显著降低,通过计算其病情指数,我们得出野生型WT的病情指数为92±3.6,△FoSIX1A为8±1.2,△FoSIX4为35±4.1,△FoSGE1无发病症状,其生物量与病情指数正相关,说明,基因敲除SIX1A、SIX4以及SGE1,抑制其表达,能够延缓病原菌在根系中的生长和扩散速度,从而影响致病性。 为进一步阐明上述突变体致病性丧失的机理,利用液相色谱仪测定和比较突变前后菌株生物合成镰刀菌酸(FusariumAcid,FA)的能力,发现△FoSGE1菌株生物合成镰刀菌酸的量显著下降,进一步利用qPCR验证确认FA生物合成相关基因Cluster也显著下调表达,说明SGE1的基因表达水平也对FocTR4生物合成FA有显著的调控作用。