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目的: ampG基因编码的AmpG蛋白是一种跨膜蛋白，其转运胞膜外糖肽至胞内，诱导AmpC酶的表达。因此，开展AmpG结构与功能的关系及其对细胞内AmpCβ-内酰胺酶表达水平影响的研究具有特别重要的意义，也为探寻有应用前景的抑制跨膜转运蛋白功能的药物打下实验基础，对细菌性感染的治疗具有重要的理论意义和应用前景。 方法: 1.提取基因组模板:本课题以本实验室保存的铜绿假单胞菌标准株PAO1为实验菌株来源，采用SDS法提取基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA。 2.重组PCR:根据预测的AmpG氨基酸保守位点设计引物，以提取的铜绿PAO1的基因组DNA为模板，通过重叠延伸PCR技术定点突变ampG基因，使其编码的AmpG蛋白的第129、131个氨基酸发生突变，获得重组片段ampG，电泳检测并回收重组片段ampG。 3.构建克隆载体（TA克隆）:本实验选用pMD18-T载体，目的片段ampG经纯化后连接到pMD18-T Simple Vector上，得到连接产物T-ampG;将连接产物T-ampG转化到感受态JM109细菌中;行蓝白斑筛选，以确认pMD18-T载体中是否连接上了目的片段ampG，经质粒提取和酶切鉴定后为阳性的菌株，保种后取部分送去测序验证。 4.构建表达载体:将ampG片段克隆到pUCP24载体，得到连接产物pUCP24-ampG;将pUCP24-ampG转化感受态JM109，筛选得到含有pUCP24-ampG质粒的重组子。 5.pUCP24-ampG质粒转化感受态PAO1△ampG，筛选出PAO1△ampG-ampG菌株。 6.PAO1△ampG-ampG菌株进行药敏实验(Amp-MIC):以不含药物的MH平板做对照，以ATCC25922作质控菌株，以PAO1、PAO1△ampG、PAO1△ ampG-ampG作为对照菌株，采用CLSI推荐的琼脂二倍稀释法测定各种细菌对氨苄西林（Amp）的敏感性及测定其MIC（最低抑菌浓度）值。 7.PAO1△ampG-ampG菌株β-内酰胺酶活性测定:以头孢呋辛钠(50μg/ml)为诱导剂，测定PAO1、PAO1△ampG、PAO1△ampG-ampG、PAO1△ampG-ampG菌株诱导前后的β-内酰胺酶比活性。 8.PAO1△ampG-ampG菌株的RT-PCR验证ampG基因的表达:将PAO1、PAO1△ampG、PAO1△ampG-ampG、PAO1△ampG-ampG各个突变株送上海尼桑生物科技有限公司进行RT-PCR，以PAO1为对照，测出各PAO1△ampG-ampG菌株ampG基因mRNA相对转录比。 结果: 1.重组PCR结果:以铜绿假单胞菌PAO1基因组DNA为模板，分别扩增出突变位点上下游片段，结果得到约250bp的上游片段和1550bp的下游片段，再以上、下游片段为模板，进行重组PCR扩增，结果得到约1800bp的条带，与PAO1ampG基因长度(1785bp)相一致，回收得到ampG片段。 2.将ampG片段克隆至PMD18-T Simple载体，转化JM109后在含有氨苄平板上筛选含重组子T-ampG菌株，提取质粒酶切鉴定，再经测序鉴定正确，突变成功。将T-ampG双酶切，可见约2700bp和1800bp大小的条带，大小与PMD18-T载体及ampG片段一致。 3.将ampG片段克隆至pUCP24载体，转化至JM109并在庆大霉素平板上筛选出含重组子pUCP24-ampG质粒的菌株，提取质粒，双酶切鉴定得到约4000bp和1800bp的片段，大小与pUCP24载体及ampG片段一致，证明pUCP24-ampG质粒重组成功。 4.将pUCP24-ampG质粒转化至PAO1△ampG，提取质粒酶切鉴定，得到PAO1△ampG-ampG重组菌株。 5.Amp-MIC、酶活性测定及实时定量PCR结果:以ATCC25922为质控株，PAO1、PAO1△ampG、PAO1△ampG-ampG为对照株，进行Amp-MIC、诱导前后酶比活性测定及RT-PCR，寻找出对氨苄西林MIC(Amp-MIC)有明显改变的PAO1△ampG-ampG重组株，结果显示129up1、129up5、129up6三重组株Amp耐药性、酶比活性及AmpG mRNA转录水平显著降低，129其余的三株及131重组株无显著变化;推测第129位氨基酸可能是AmpG功能关键性位点。 结论: 1.从方法学角度上来讲，重组PCR技术是常用的基因定点突变技术，能向目的DNA片段引入所需变化，能高效、迅速地提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。 2.ampG基因编码的AmpG蛋白是诱导型AmpCβ-内酰胺酶的一个重要的信号转导蛋白，其对AmpC酶的高水平表达是必须的。 3.初步鉴定得出129位点是铜绿假单胞菌AmpG的功能域关键性位点，131位点不是AmpG的功能关键位点。