树突状细胞(dendritic cells，DC)是一类功能强大，并且是唯一能够激活初始T细胞的抗原提呈细胞，在识别和提呈抗原、启动免疫应答、诱导移植排斥反应中起着重要的作用。由于DC是一类异质性细胞群体，具有不同的亚群和不同的功能状态，不但在增强免疫反应上具有重要的作用，也具有抑制排斥反应、诱导特异性免疫耐受的潜力。有研究表明，未成熟DC缺乏共刺激分子CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的表达，体外能够诱导同种抗原特异性的T细胞失能。体内未成熟DC存在着自然发育成熟的内在机制，而且器官移植术后受者体内产生的多种介质，如致炎性细胞因子、LPS等，均能促进DC分化成熟，使之拥有强大的免疫原性。因此，一些调控手段，如免疫抑制分子1，25-二羟维生素D共培养或白细胞介素10(interleukin10，IL-10)、转化生长因子β(transforming factorβ，TGF-β)等修饰，可以使DC维持于稳定的未成熟状态，增强其耐受原性，是减轻移植排斥反应、诱导特异性免疫耐受的重要途径并具有潜在的临床应用价值。　　根据多个实验室的研究报道，PD-L1对T细胞反应的影响有共刺激和抑制两种作用情况，具体机理尚未完全阐明，目前尚有争议性。已有学者指出T细胞受刺激活化5～15分钟后，B7-H1和B7-DC先与其第二未明活化受体结合，上调T细胞表面CD40L的表达，促进T细胞的进一步活化;而24小时后，T细胞开始表达PD-1，PD-L/ PD-1途径占主导作用，介导T细胞的凋亡并下调细胞因子的分泌，对T细胞的增殖产生抑制作用。PD-L1/PD-1共刺激途径可抑制T细胞受体介导的淋巴细胞增殖反应和细胞因子分泌，B7-H1缺陷鼠的表型亦表明B7-H1在体内有重要的负性调节作用。PD-L1/PD-1通路在移植免疫中起着重要作用。PD-L1/PD-1通路可抑制移植动脉病(graft arterial disease，GAD)。也有研究表明，PD-L1/PD-1通路提供给T细胞信号，影响着急性移植物抗宿主病(graft-vs-host disease，GVHD)的致死率。　　鉴于PD-L1对DC发育及免疫功能的重要调控作用，我们设想采用新型基因工程技术致敏未成熟DC，将会减缓或阻止DC的成熟过程，体内回输有利于减轻排斥反应，并可能诱导稳定、有效的供者特异性免疫耐受。　　本研究通过构建高表达mPD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株，纯化制备mPD-L1-IgG1融合蛋白;体外培养、扩增并富集小鼠骨髓来源的DC，采用融合蛋白致敏未成熟DC，研究mPD-L1-IgG1致敏的未成熟DC的表型及功能的变化，以及体外诱导同种抗原特异性T细胞低反应性的作用和效果;通过建立小鼠同种异体异位心脏移植模型，观察mPD-L1-IgG1-DC体内减轻排斥反应、诱导心脏移植免疫耐受的效果，并探讨了可能的机制。　　第一部分 酵母表达的PD-L1-IgG1融合蛋白表达、纯化和鉴定　　一、酵母表达mPD-L1/mIgG1Fc工程菌的构建　　目的:构建高表达mPD-L1/mIgG1Fc的酵母工程菌。　　方法:将mPD-L1基因与mIg基因依次定向克隆入酵母pPIC9k载体构建pPIC9k-mPD-L1-Ig融合基因表达质粒;以表达质粒电穿孑L酵母感受态菌GS115，经MD板营养筛选、和G418+抗性筛选高拷贝酵母菌株。　　结果:成功构建了高表达PD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株。　　结论:构建了mPD-L1/mIgG1Fc酵母表达的工程菌，为下一步蛋白纯化研究打下了良好基础。　　二、mPD-L1-mIgG1-Fc融合蛋白的表达与纯化研究　　目的:将成功构建了高表达PD-L1-IgG1融合蛋白的酵母菌株进行纯化、鉴定。　　方法:探索不同诱导时间和溶解氧含量对融合蛋白发酵表达产量的影响;探索和优化酵母上清中融合蛋白的各种纯化制备条件;建立新型融合蛋白的鉴定方法。　　结果:确定了酵母菌株的发酵条件是发酵72小时，甲醇诱导浓度是8ml/h，优化了融合蛋白的纯化方法，建立了mPD-L1-Ig融合蛋白的纯化流程，最终获得了纯度＞95％的mPD-L1-IgG1融合蛋白，内毒素含量低于0.03pg/μg蛋白。　　结论:制备了符合生物学功能实验要求的mPD-L1-Ig融合蛋白，为进一步开展功能研究打下了良好基础。　　第二部分 PD-L1-IgG1融合蛋白维持DC未成熟状态和低反应性　　目的:建立PD-L1-IgG1融合蛋白致敏DC方法，研究融合蛋白维持DC未成熟状态和诱导DC低反应性的能力。　　方法:用mPD-L1-IgG1融合蛋白致敏体外扩增的第5天的BALB/c小鼠骨髓来源的未成熟DC，流式细胞仪检测LPS刺激前后致敏DC的表型改变;将BALB/c来源的LPS-DC、imDC和mPD-L1-IgG1-DC，以不同比例与C57BL/6小鼠来源的T细胞进行混合淋巴细胞反应(MLR)，并检测反应上清中细胞因子的含量;将BALB/c小鼠来源的imDC和mPD-L1-IgG1致敏DC分别经尾静脉注入C57BL/6小鼠体内（2×106细胞/只），7天取受者脾脏，检测受者脾脏T细胞与供者和无关第三者脾脏淋巴细胞的MLR情况。　　结果:致敏DC表面高表达mPD-L1-IgG1融合蛋白，致敏DC能有效抵抗LPS刺激而维持未成熟状态，其表面CD80、CD86及HLA-DR等分子的表达下调;MLR反应中致敏DC刺激同种异基因T细胞增殖的能力显著低于对照组，分泌Th1因子(IL-2、IFN-γ)显著下降， Th2因子(IL-4、TGF-β)则明显上升;致敏DC免疫组脾脏T淋巴细胞接触供者抗原时，表现出明显的低反应性。　　结论: mPD-L1-IgG1能有效致敏未成熟DC，维持DC表型和功能保持未成熟状态，诱导DC低反应性。　　第三部分 小鼠心脏移植急性排斥反应模型的建立　　目的:建立可用于移植急性排斥反应研究的小鼠心脏移植模型。　　方法:实验组的供、受体分别来自BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠;对照组的供、受体来自BALB/c小鼠，每组各20对。采用Cuff血管吻合技术，在小鼠颈部进行异位心脏移植。心脏移植术后第7天，每组10只取移植心脏组织，用石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色，进行组织病理学分析。观察每组其余存活受体小鼠的移植心脏存活期。　　结果:手术成功率达92.5％(37/40)。移植后第7天病理组织检查结果显示:实验组排斥反应等级为3.55±0.44，对照组为0.40±0.32，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。实验组移植心脏存活(8.22±0.67)d，对照组移植心脏存活＞100 d，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。　　结论:采用Cuff血管吻合技术，将BALB/c小鼠心脏移植至C57BL/6小鼠，可以建立稳定的小鼠心脏移植急性排斥反应模型。该方法手术成功率高，值得推广。　　第四部分 PD-L1-IgG1-DC诱导小鼠心脏移植免疫耐受的作用和机制　　目的:建立PD-L1-IgG1-DC诱导小鼠心脏移植免疫耐受模型，探索其体内负向免疫作用机制。　　方法:选择C57BL/6小鼠为受体，在移植前7天，经尾静脉注入BALB/c小鼠来源的Day5-DC和PD-L1-IgG1-DC(2×106细胞/只)，PBS组为对照，进行颈部异位心脏移植术，观察各组心脏移植物的存活期;术后第7天观察心脏移植物的病理改变，并测定体内血清细胞因子水平;分析受者脾脏T细胞对供者抗原的刺激反应和CTL效应。　　结果:PD-L1-IgG1-DC组心脏移植物平均存活天数为(24.2±3.29)d，比Day5-DC组和对照组均明显延长(P＜0.01);致敏DC组心脏移植物的病理改变明显轻于其它2组，血清中Th1细胞因子(IL-2、IFN-γ)水平较其它2组减低，而Th2细胞因子TGF-β水平升高、IL-4水平无明显差异;PD-L1-IgG1-DC组脾脏淋巴细胞对供者抗原的刺激反应下降明显(P＜0.01)，其在CTL反应中对靶细胞的杀伤活性明显弱于Day5-DC组和对照组(P＜0.01); PD-L1-IgG1-DC免疫组小鼠体内的CD4+CD25+Foxp3+ Treg调节性T细胞显著升高。　　结论:PD-L1-IgG1-DC能够有效诱导小鼠心脏移植的免疫耐受，具有较强的免疫负向应答调控性能，其免疫负向调控功能主要由PD-L1诱生。　　全文总结　　mPD-L1-IgG1融合蛋白可以有效致敏未成熟DC，制备mPD-L1-IgG1-DC，该新型DC在体外可抑制同种异基因T细胞的增殖，并抑制Th1细胞因子产生;BALB/c小鼠来源的mPD-L1-IgG1-DC经尾静脉注入C57BL/6小鼠体内，可诱导受者对供者的抗原特异性低反应性。应用小鼠同种异体心脏异位移植模型证实，移植前7d经尾静脉注射mPD-L1-IgG1-DC可以有效地延长心脏移植物的存活时间，明显地减轻移植心脏的病理改变。体内作用机制分析表明mPD-L1-IgG1-DC可以借助PD-L1的效应有效诱生调节性T细胞从而维持机体免疫耐受状态。本实验研究了mPD-L1-IgG1融合蛋白致敏的DC作为致耐原诱导移植免疫耐受的作用，为进一步探索用免疫负向因子调控DC亚群防治移植排斥反应提供了新的实验依据。