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研究背景目前,食管癌是全球常见的消化道恶性肿瘤之一,发病率与死亡率分别位列全球癌症第七位和第六位,而我国是排名最靠前的。根据食管癌组织病理学形态特征的不同,可以将食管癌分成两种不同的亚型:食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma,EAC）,在中国食管癌病例中,食管鳞状癌的占比高达90%以上。食管鳞癌的特点是患者早期无明显的发病症状,所以食管鳞癌患者通常在确诊时病程已经到中晚期,同时大概率还伴有肿瘤转移的发生,而转移成为大多数食管癌患者死亡的重要原因。因此,阐明食管癌转移的机制和关键靶点,并开发靶向性药物,是改善食管癌患者生存率的重要策略。上皮细胞向间充质细胞的转变（epithelial to mesenchymal transition,EMT）是肿瘤细胞发生侵袭、转移的一个关键步骤。随着研究的不断深入,发现EMT受MAPK、Wnt/β-catenin、Hedgehog等多个信号通路调控,而且在食管癌组织中Hedgehog等通路处于高度活化状态。这些研究结果有助于我们更好的寻找食管癌中调控EMT过程的靶标,从而阻断转移进一步的发展。课题组前期研究发现,在食管鳞癌细胞中Hedgehog信号通路的下游效应分子Gli3可以调控的EMT的进展,从而促进食管鳞癌的转移。同时还发现双氢青蒿素（Dihydroartemisinin,DHA）可以抑制食管鳞癌的转移;DHA处理的食管鳞癌细胞的磷酸化组学中,Gli3丝氨酸664位点(Gli3S664)的磷酸化水平发生了明显降低。Gli3S664在食管癌的转移中具体发挥什么样的作用,DHA是如何影响其变化的?这些问题都是值得探讨的,将有助于我们更好的理解食管癌的转移机制。本课题首先明确了Gli3 S664位点的磷酸化促进食管鳞癌细胞迁移侵袭的作用。进而通过激酶组模体分析筛选出Gli3S664上游激酶,即富含丝氨酸/精氨酸的蛋白质特异性激酶1（Serine/Arginine-Rich Protein-Specific Kinase 1,SRPK1）,然后利用体外激酶实验、IP实验等确认SRPK1对Gli3S664的激活;通过细胞迁移、侵袭表型实验和免疫印迹等实验探究SRPK1-Gli3S664在食管癌转移中的作用及机制。利用pull down、体外激酶实验等阐明DHA通过靶向SRPK1,进而降低Gli3S664的磷酸化水平的具体机制,为将来DHA用于临床抗食管鳞癌复发转移打下基础。方法1.探究Gli3的S664位点的磷酸化在食管鳞癌中的作用（1）构建过表达的野生型Gli3、S664磷酸化位点失活突变（S664A）和S664磷酸化位点激活突变（S664D）食管鳞癌KYSE30和KYSE150细胞系,通过蛋白质免疫印迹（Western blot）验证细胞系构建是否成功。（2）通过细胞增殖实验、平板克隆形成实验、划痕实验以及Transwell实验探究Gli3S664的磷酸化对食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150的增殖和转移表型的影响。（3）通过Western blot检测在食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150中,不同磷酸化水平的Gli3S664对EMT相关分子的影响。2.探究SRPK1对Gli3S664位点磷酸化的调控（1）利用生信分析技术筛选Gli3S664位点潜在的上游激酶。（2）通过Western blot检测食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150经不同浓度SRPK1的特异性抑制剂SRPIN340处理后,Gli3S664磷酸化水平变化。（3）通过免疫荧光实验探究在食管鳞癌细胞KYSE30中SRPK1与Gli3的共定位情况。（4）利用免疫共沉淀实验研究SRPK1与Gli3在细胞内是否具有相互结合的作用关系。（5）通过体外激酶实验验证SRPK1是否可以磷酸化Gli3S664。3.探究Gli3对SRPK1促转移功能的介导作用（1）利用CRISPR/Cas9技术敲除SRPK1或利用脂质体包裹方法瞬时转入p CDNA-3.1（+）-HA-SRPK1质粒过表达SRPK1,分别观察SRPK1的表达变化对食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150迁移和侵袭的影响,以及对Gli3S664、EMT相关分子表达的影响。（2）在稳定过表达荧光素酶基因的KYSE150细胞的基础上利用sg RNA-SRPK1敲除SRPK1,然后通过尾静脉注射细胞的方式构建敲除SRPK1的食管癌细胞小鼠肺转移模型。每周通过小动物活体成像仪观察小鼠体内肿瘤细胞转移情况,探究敲除SRPK1在体内对食管鳞癌细胞转移的影响。（3）构建过表达SRPK1联合敲低Gli3的食管鳞癌细胞系,通过划痕实验和Transwell实验探究在食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150中Gli3是否介导SRPK1在食管鳞癌中的促转移作用。4.探究DHA通过调控SRPK1/Gli3S664对食管鳞癌转移的影响（1）通过Pull down实验检测KYSE150和KYSE30细胞中DHA与SRPK1的结合能力。（2）通过体外激酶实验探究DHA是否能够抑制SRPK1激酶对Gli3S664的磷酸化作用。（3）利用课题组前期建立的“DHA对食管癌患者来源的异种移植瘤模型（patient-derived xenografts,PDX）的影响”的实验瘤组织标本,通过免疫组织化学染色法评价DHA对SRPK1的表达和Gli3S664磷酸化水平的影响。结果1.细胞增殖实验、平板克隆形成实验、划痕实验、Transwell实验以及免疫印迹结果显示,Gli3S664磷酸化能够显著促进食管鳞状细胞癌的增殖、迁移和侵袭以及EMT的发展。2.SRPK1能够磷酸化Gli3的S664位点（1）激酶组模体分析发现SRPK1潜在调控Gli3S664位点的磷酸化。（2）与对照组相比,SRPK1抑制剂SRPIN340显著抑制了食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150中Gli3S664的磷酸化水平。（3）免疫共沉淀实验与免疫荧光实验结果表明SRPK1能够在细胞质内与Gli3结合。（4）体外激酶实验结果证实SRPK1可以磷酸化Gli3S664。3.Gli3介导了SRPK1在食管鳞癌中的促转移功能（1）敲除SRPK1抑制了Gli3S664的磷酸化水平以及影响EMT相关蛋白的表达,进而抑制食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150的迁移和侵袭;过表达SRPK1促进了Gli3S664的磷酸化以及影响EMT相关蛋白的表达,进而促进食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150的迁移和侵袭。（2）小鼠食管鳞癌细胞肺转移模型实验结果显示敲除SRPK1抑制食管鳞癌细胞的肺转移。（3）在食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150中敲除Gli3均能减弱SRPK1过表达引起的促转移能力。4.DHA通过下调SRPK1介导的Gli3S664磷酸化抑制食管鳞癌细胞的转移（1）Pull down和体外激酶实验的结果显示DHA能够与SRPK1结合并抑制SRPK1对Gli3S664磷酸化的激活。（2）免疫组织化学结果显示DHA可降低食管癌来源的小鼠PDX模型肿瘤组织的Gli3S664磷酸化水平,而对SRPK1蛋白水平没有直接影响。结论SRPK1通过磷酸化Gli3S664促进人食管鳞癌细胞的转移,DHA能够靶向SRPK1/Gli3S664抑制食管鳞癌细胞的转移。