论文部分内容阅读
目的及意义:Fb作为创伤愈合时的主要效应细胞,在以HS为特征的病变中,常常表现为凋亡抑制,但是目前的研究尚未完全明了调控HSFb凋亡的分子机制,因此,如果能够找到新的促进HSFb凋亡的信号途径,那么就将有可能为控制HS的发生发展提供新的理论基础。我们过去运用基因芯片从中筛选出一个具有抑制细胞凋亡作用、在早期HS中呈显著高表达的基因SARP1。该基因可能在HS形成的过程中起着重要作用。那么,SARP1对增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的调节作用是什么?SARP1参与调控成纤维细胞凋亡的信号途径及其分子机制是什么?这些问题鲜见文献报道。为此,我们构建了携带人SARP1基因的重组腺病毒载体,在HSFb中表达SARP1蛋白,观察SARP1蛋白表达对HSFb增殖及凋亡的影响,并进一步研究其相互作用蛋白,初步探讨SARP1调控HSFb凋亡的信号途径中的可能的新的分子机制。为明确SARP1调控人HSFb凋亡的分子机制奠定基础。方法:1.通过PCR方法扩增人SARP1基因,将获得的目的基因连接进入腺病毒载体,酶切及测序鉴定之后,使用脂质体转染法在293T细胞中制备重组腺病毒。2.使用腺病毒感染的方法在HSFb中表达SARP1蛋白,通过RT-PCR及western blot方法对蛋白表达进行鉴定。3.利用MTT法检测SARP1蛋白表达对人HSFb生长增殖的影响,利用Annexin V-PI染色、流式细胞术检测的方法观察SARP1蛋白表达对HSFb凋亡的影响。4.免疫共沉淀及蛋白质组方法分离SARP1的相互作用蛋白;使用LC-ESI-MS/MS质谱技术对分离得到的蛋白质进行鉴定。结果:1.酶切及测序证实含SARP1基因片段的重组腺病毒质粒载体构建成功,腺病毒感染人HSFb后,RT-PCR方法可在细胞中检测到SARP1蛋白mRNA表达,westernblot方法可检测到SARP1蛋白表达,证实SARP1蛋白可在人HSFb中高表达。2. SARP1蛋白在人HSFb中表达后细胞的生长增殖明显加快,与对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。3. SARP1蛋白在人HSFb中表达后细胞的凋亡率(2.86%)明显低于对照组(8.03%) ,二者具有显著性差异(p<0.05)。4.用免疫共沉淀方法在腺病毒感染的人HSFb细胞中分离得到7条蛋白条带;质谱方法鉴定出10个蛋白,其中6个蛋白可能为SARP1的相互作用蛋白,它们分别为: periostin(OSF-2)、PLAP-1、phosphoglyceratekinase 1、rCG50690、Apolipoprotein A-I precursor、Thioredoxin 1 (TRX1)。结论1.成功构建携带增强型绿色荧光蛋白的人SARP1重组腺病毒,病毒滴度高。2.可使用腺病毒感染的方法在人HSFb细胞中高表达SARP1蛋白。SARP1蛋白对人HSFb具有抑制凋亡、促进增殖的作用。3. periostin(OSF-2)、PLAP-1、phosphoglyceratekinase 1、rCG50690、Apolipoprotein A-I precursor、Thioredoxin 1 (TRX1)可能是SARP1的相互作用蛋白,SARP1蛋白与这些蛋白的相互作用可能是SARP1调控HSFb抗凋亡信号途径中的重要分子机制。