论文部分内容阅读
以小麦为材料，对小麦幼苗草酸氧化酶(OxO)进行了纯化，探讨了OxO的酶学性质和化学修饰；分析了不同光照强度对苗期OxO活性的影响和成熟期OxO活性的变化和测定了苗期、成熟期的相关生理生化指标；从小麦DNA中扩增gf-2．8，在大肠杆菌、酵母中表达gf-2．8，并制备了检测萌发素的Western杂交用的第一抗体；通过农杆菌介导法用gf-2．8转化烟草、拟南芥，得到PCR和卡那霉素检测的阳性植株。本文旨在建立高效简便的小麦OxO纯化方法、了解OxO催化反应机理、OxO在萌发后的幼苗期和成熟期的生理功能与调节机理，为进一步研究OxO的生物学功能及H202在信号传递中的作用奠定基础，为建立具有自主知识产权的OxO商业应用提供技术贮备。
通过酸热变性、超滤浓缩、SephadexG．100凝胶过滤、ConcanavalinA亲和层析四个步骤得到了电泳纯小麦幼苗OxO部分纯化制剂，纯化倍数为66．¨倍，回收率21．93％，SDS-PAGE测定OxO亚基分子量为32．6kD。
等电聚焦测定OxO的pI为7．6，高于预测值(预测值为6．34)；凝胶过滤法测定全酶分子量为172kD；0．6mmol／L的草酸抑制OxO的活性，Km=0．2072mmol／L；OxO的最适pH为3．5；化学修饰法表明，含游离羧基的氨基酸和Lys可能为酶的必需基团，Cys只是起到维持酶正常构象的作用，但化学修饰法不能证明His为酶的必需氨基酸。
测定了小麦萌发后苗期不同光照条件下OxO活性、SOD活性、POD活性、CAT活性、乙醇酸氧化酶活性、草酸含量和H202含量变化，并以gf-2．8为探针对总RNA杂交，结果表明，低光照强度下OxO活性高于较高光照强度下OxO活性，低光照能够促进OxOmRNA的表达，OxO为小麦幼苗产生H202的主要来源，低光照条件下，POD的活性较低，CAT无明显变化，推测H202积累的原因是由于OxO活性上升与POD活性下降造成的，而不是CAT活性水平的降低。
测定了小麦成熟期花结构中的外桴、内桴及浆片的OxO活性变化及相关生理生化指标，外桴、内桴及浆片中OxO活性在扬花后第35天达到最大值，活性水平与苗期低光照的维管转换区相近，H202含量高于苗期，而POD活性低于苗期，木质素在扬花后第10-45天呈上升趋势，提示H202的积累是由于OxO分解草酸和较低活性水平的POD使其分解减缓，同时，较低活性水平的POD能够维持木质素的合成。成熟期由于花结构中蛋白质含量明显低于苗期，而OxO活性水平与苗期相近，成熟期OxO比活性较苗期高。
对fY-2．8进行了在大肠杆菌中原核表达和在酿酒酵母中表达，均检测不到OxO活性，以原核表达产物为抗原制备的第一抗体与不同时期的小麦幼苗的OxO提取液杂交，浸种第4天杂交信号较强，第10天、第12天只能检测到很弱的信号，与OxO活性检测结果一致，说明随生长天数的增加，OxO活性下降的原因是由于OxO的减少，Northern杂交也表明，随培养天数的增加，mRNA的表达量下降。
通过转基因操作，得到PCR检测和含卡那霉素培养基筛选的烟草Tl代阳性植株、拟南芥T2代阳性植株。经Southern杂交检测，证实已获得转基因植物。