研究背景:长久以来,创面愈合一直是医学界深入研究的主题之一。对于烧伤整形外科医生来讲,经常会遇到由于外伤或烧伤等原因所导致的皮肤缺如的修复,因此掌握皮肤创面的愈合机制及过程,以及相关的治疗手段非常必要。创面修复历经复杂的生物学过程,包括炎症细胞浸润、肉芽组织填充、表皮细胞增殖、以及瘢痕组织重新塑形等过程,这些步骤既相继发生又彼此重叠。并需要多种功能细胞的参与,如中性粒细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、表皮细胞等,它们在细胞因子的趋化下,自创周组织血管内迁移至创面床,清除组织碎片、产生胶原等基质、完成创面封闭。如果上述细胞的生物学行为失常,将会造成创面修复延迟甚至修复困难,包括出现瘢痕增生等过度修复现象。上皮组织重建在创面愈合进程中至关重要,这个过程中需要角质形成细胞从创伤的边缘通过细胞增殖以及迁徙来修复创面。因此,对于角质形成细胞增殖和迁移的调控机制研究有助于我们掌握创面的愈合过程并为临床治疗提供理论依据。在创面愈合过程中,有一系列的基因和信号通路调控角质形成细胞迁移和增殖。在这当中,BCL-2/腺病毒E1B19kDa结合蛋白3(BNIP3)逐渐引起了人们的重视。最近有研究表明:BNIP3能够促进角质形成细胞在缺氧情况下的运动和转移,并且参与修复低氧诱导的神经元损伤,可以作为临床促进创面愈合的潜在分子靶点。然而BNIP3在创面愈合中的调控机制尚不清楚。许多报道microRNAs(miRNAs)在包括创面愈合的多种疾病中发挥靶点作用。miRNA是一类长度有22个核苷酸大小的内源性非编码RNA,通过靶定基因的3’-非翻译区域(UTR)调控基因的表达,发挥转录抑制作用。miRNA能够通过调控多种目标mRNA表达,来完成对细胞增殖、凋亡和分化等一系列细胞生物学功能的调节。另外,大量研究表明miRNA参与调控细胞增殖、免疫因子的释放、细胞外基质的重建和创面愈合时的血管生成。根据TargetScan预测miR-96-5p 为 BNIP3 的上游调控 miRNA,BNIP3 的 3’-UTR 段与 miR-96-5p 有相互作用位点,并且文章报道miR-96-5p参与对成纤维细胞增殖和分化的调控。鉴于这些发现,我们的研究试图探究miR-96-5p对BNIP3的调控机制,研究miR-96-5p通过调控BNIP3基因表达促进创面愈合的机制,为临床应用提供理论依据。黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)也称pp125FAK,在整合素的信号转导中发挥着重要作用。研究发现:FAK可与细胞内信号转导蛋白相互作用,形成局部黏着斑,参与调节细胞的黏附、迁移、增殖、凋亡等过程,细胞的凋亡也与其表达水平有关,FAK过表达有可能阻止细胞凋亡。也有文献表明FAK可能参与对表皮细胞的迁移的调控,进而促进创面愈合。特异性的整合素单克隆抗体可下调FAK的表达水平并抑制表皮细胞迁移;如果FAK缺失,则小鼠创面的愈合明显延迟。有研究表明,细胞内肌动蛋白骨架的聚合、解聚及重排与FAK信号传导通路密切相关,其下游信号参与了细胞迁移相关环节的调节,而BNIP3与细胞肌动蛋白骨架的重构有关。因此FAK可能参与了BNIP3对表皮细胞迁移的调控。研究目的:本课题旨在通过实验解决下列问题:1、探讨miR-96-5p和BNIP3的表达水平在皮肤损伤的愈合过程当中是如何变化的,是否具有相关性;2、验证BNIP3是否能够调控人角质形成细胞的增殖及迁移;3、探讨BNIP3是否是miR-96-5p的一个直接下游靶基因以及miR-96-5p如何调控BNIP3的表达;4、探讨miR-96-5p对人角质形成细胞的增殖和迁移是否起到调控作用;5、验证miR-96-5p是否通过BNIP3介导的FAK信号通路调控皮肤创面愈合。研究方法:1、构建皮肤损伤模型:随机选取15只Sprague-Dawley大鼠进行皮肤创伤模型的建立,大鼠背部脱毛,麻醉后用3 mm皮肤穿孔器在脱毛部位造成创伤,在创伤后1天、3天、5天和7天时用4 mm皮肤穿孔器在创伤位置取损伤组织,同时在健康鼠的同一位置取皮肤组织;2、提取创面及健康组织中的蛋白质,通过Western blot检测损伤组织与健康组织间BNIP3的蛋白表达差异;3、提取创面及健康组织中的RNA,通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测损伤组织与健康组织miR-96-5p的差异性表达;4、人原代角质形成细胞(HPK)购买自美国模式培养物集存库,进行培养及传代;5、构建 BNIP3 过表达质粒 pcDNA3.1-BNIP3;6、将培养传代的HPK分为四组:转染pcDNA3.1-BNIP3组、转染BNIP3-siRNA组、阴性对照组及空白对照组;Western blot方法检测各组细胞BNIP3的蛋白表达水平;7、用MTT 比色法检测转染pcDNA3.1-BNIP3的HPK的细胞活力,用细胞划痕实验方法检测其迁移能力;8、用MTT 比色法检测检测转染BNIP3-siRNA的HPK的细胞活力,用细胞划痕实验方法检测其迁移能力;9、利用TargetScan生物信息学分析与靶点预测网站进行miRNA靶基因的预测;10、根据TargetScan预测miR-96-5p为BNIP3的上游调控miRNA,首先将BNIP3的3’-UTR片段突变,将野生型或突变型的BNIP3 3’-UTR克隆到含有荧光酶报告基因载体pmirGLO的下游,并且与miR-96-5p mimics共转染到HPK中,72小时后计算相对荧光素酶活性值,检测在miR-96-5p mimics存在的情况下能否导致荧光素酶活性的改变;1 1、分别用 miR-96-5p mimic、miR-96-5p inhibitor 转染 HPK,并与各自阴性组细胞做对照;12、用 MTT 比色法检测转染 miR-96-5p mimics 或 miR-96-5p inhibitor 的 HPK的细胞活力;13、用细胞划痕实验方法检测转染miR-96-5p mimics或miR-96-5p inhibitor后细胞的迁移能力;14、提取转染miR-96-5p mimics或miR-96-5p inhibitor细胞及对照组细胞的miRNA,qRT-PCR 检测 miR-96-5p 的表达水平;15、提取转染miR-96-5p mimics或miR-96-5p inhibitor细胞及对照组的细胞蛋白,用Western blot方法检测BNIP3的表达水平以及FAK信号通路关键基因FAK的磷酸化蛋白(p-FAK)表达水平;16、统计学处理:所有结果均以三次重复测量的平均值±标准差表示。两组间的差异采用SPSS 15.0统计软件,采用t检验进行评估;在比较两组以上时采用单因素方差分析进行评估。配对组织比较采用配对t检验确定统计学意义,如果P<0.05,则差异有统计学意义。实验结果:1、Western blot结果显示:与大鼠健康组织相比,BNIP3在大鼠皮肤损伤组织中的蛋白表达量明显升高,并且随着愈合天数的增多,BNIP3的蛋白表达量明显增加,(P<0.05);2、qRT-PCR结果显示,皮肤损伤组织中miR-96-5p的表达量随着创面愈合天数的增加表达逐渐降低(P<0.05),这与BNIP3的表达水平相反;3、Western blot 检测转染 pcDNA3.1-BNIP3 或转染 BNIP3-siRNA 后 HPK的BNIP3表达水平显示:转染pcDNA3.1-BNIP3的细胞,BNIP3的表达水平明显升高(P<0.05),而 BNIP3-siRNA 组明显下降(P<0.05);4、MTT 比色法检测细胞活力:与对照组相比,HPK转染pcDNA3.1-BNIP3质粒后的细胞活力明显增强(P<0.05),而转染BNIP3-siRNA的细胞活力降低(P<0.05);5、细胞划痕试验表明,转染pcDNA3.1-BNIP3质粒后HPK的迁移能力明显升高(P<0.05);而转染BNIP3-siRNA的细胞迁移能力明显降低(P<0.05);BNIP3对HPK有促增殖、促迁移的作用;6、野生型BNIP3与miR-96-5p mimics共转染HPK能够降低荧光素酶活性(P<0.05),提示miR-96-5p能够下调BNIP3的表达,而突变型BNIP3与miR-96-5p mimics共转染则未出现荧光素酶活性降低;7、BNIP3在蛋白水平上的表达量由于miR-96-5p mimics的转染而显著减少(P<0.05),而在miR-96-5p inhibitor作用下BNIP3蛋白的表达量明显增加(P<0.05);8、MTT实验表明:转染miR-96-5p mimics后的HPK增殖速率与阴性对照组相比明显抑制(P<0.05),miR-96-5p inhibitor处理后HPK的增殖活力增加(P<0.05);9、细胞划痕实验表明:miR-96-5p mimic转染组HPK的迁移能力明显受到抑制(P<0.05)。,然而miR-96-5p inhibitor处理后细胞的迁移能力增加(P<0.05);10、qRT-PCR 检测显示:miR-96-5p mimic 转染 HPK 可诱导 miR-96-5p 过表达(P<0.05),miR-96-5p inhibitor 转染 HPK 抑制 miR-96-5p 表达(P<0.05);11、miR-96-5p mimics 转染 HPK 后 p-FAK 表达下降(P<0.05),而 miR-96-5p inhibitor作用下p-FAK表达升高(P<0.05)。证明miR-96-5p对细胞增殖和迁移的调控作用与BNIP3介导的FAK信号通路密切相关。结论:1、大鼠皮肤损伤组织中的BNIP3蛋白与miR-96-5p的表达量随着创面愈合时间延长呈现相反的变化趋势,提示二者呈负相关;2、BNIP3过表达对HPK有促增殖、促迁移的作用,而BNIP3低表达则抑制HPK的增殖和迁移;3、HPK中的BNIP3是miR-96-5p的一个直接下游靶基因,受miR-96-5p负向调控,后者可以通过直接结合来抑制BNIP3的表达;4、miR-96-5p对于HPK的增殖和迁移具有负向调控作用;5、miR-96-5p的负向调控作用是通过抑制BNIP3的表达以及与之相关的FAK信号通路来完成的。总之,我们通过上述实验验证了 BNIP3促进创面修复的作用,证实了miR-96-5p对下游靶基因BNIP3和FAK通路的负向调控作用,为临床上促进创面愈合提供分子依据。