酶是生物体内具有高度专一催化活性的生物大分子,被喻为生命体中的催化剂。由于酶催化并主导生物体的主要新陈代谢过程,它是生物体内赖以生存的物质基础。除少数几个具有催化活性的DNA和RNA分子外,生物体内所有酶的化学本质都为蛋白质。随着酶学的不断发展,酶催化已被越来越多的应用到与人们生活息息相关的领域,如医药卫生、食品和能源等。从原子水平上对酶催化反应过程进行研究,有助于人们从化学本质上去认识酶及其催化规律,进而可以帮助人们对酶进行改造或者对其进行修饰,使其发挥出更大的利用价值。虽然可以通过实验方法对酶进行结晶并得到一些关键残基对酶催化活性的影响信息,但是,关于酶催化反应的本质及详细的反应路径目前仅靠实验手段获得还非常困难。而理论计算方法可以从微观水平上提供许多实验无法直接预测的化学反应细节以及分子结构等信息,使它成为科研工作者研究酶催化反应的一种重要工具之一。特别是近年来随着计算机技术的不断发展以及理论化学方法的不断完善,理论研究在酶催化研究领域有着较为突出的优势。本论文主要利用量子力学和分子力学相结合的QM/MM方法对几类蛋白酶的催化机理进行了系统的理论研究。通过研究,我们对于底物与蛋白酶之间的作用机制有了更深刻的认识,获得了这些蛋白酶催化反应的最可能路径以及化学键形成和断裂过程的具体细节,阐明了一些活性口袋的残基在催化反应中的不同作用和决定蛋白酶催化活性的关键因素,这些研究结果不仅有助于进一步理解这些蛋白酶的生物学功能,还可为相关酶的实验研究和应用提供重要的参考。本论文工作主要包括以下内容：(1)7-羧基-7-脱氮鸟嘌呤合成酶(QueE)催化机理研究。自然界中的许多核苷类似物都含有7-脱氮鸟嘌呤结构单元,它们一般具有较好的抗肿瘤及抗菌活性。7-脱氮鸟嘌呤类化合物的生物合成涉及到四种酶,即GCHI, QueC, QueD和QueE,其中7-羧基-7-脱氮鸟嘌呤合成酶(QueE)是一种S-腺苷甲硫氨酸(SAM)自由基依赖酶,它主要催化6-羧基-5,6,7,8-四氢蝶呤(CPH4)重排生成7-羧基-7-脱氮鸟嘌呤(CDG)。虽然QueE属于自由基SAM依赖酶,但它的结构特征与一般自由基SAM酶不同,并表现出一定的金属依赖性,它是目前发现的第一种金属依赖的SAM自由基酶.如Mg2+可使B.multivorans体内的QueE的催化活性提高三倍,但Na+却不能使QueE的活性提高。此外,相同的金属离子对来源不同的QueE的影响也不同。有人提出7-羧基-7-脱氮鸟嘌呤合成酶的催化过程涉及到复杂的结构重排,对于CPH4的闭环有两种观点：一种观点是重排过程要经过一个桥键中间体,而另外一种观点则认为反应要经过一个开环过程,特别是QueE催化的具体反应机理及钠、镁离子对反应的影响机制还不明确。基于目前得到的7-羧基-7-脱氮鸟嘌呤合成酶结合底物的晶体结构,本论文用量子力学和分子力学相结合的QM/MM方法对7-羧基-7-脱氮鸟嘌呤合成酶的催化机理进行了研究。结果表明,产物分子五元环的形成是通过一个桥键中间体的重构完成的。谷氨酸残基(Glull6)通过一个水分子夺取底物分子五元环pro-R C7位上的质子使底物分子芳香化,从而得到最终的产物。相比Mg2+, Na+显著提高了反应的能垒,并改变了反应的决速步。在整个催化反应过程中,Mg2+和Na+不仅起到路易斯酸的作用,而且能通过与底物的相：互作用固定底物的反应构型。Mg2+和Na+与底物分子之间配位方式不同是导致QueE-Mg2+和QueE-Na+具有不同活性的主要原因。通过理论研究,本文给出了QueE催化的详细反应机理,阐述了金属离子对反应的影响,给出了自由基反应传递的规律,为QueE及其他自由基SAM依赖酶的研究提供了理论依据。(2)R-羟氰裂解酶(HNL)催化机理研究。羟氰裂解酶(HNL)主要催化手性氰醇裂解生成氢氰酸(HCN)和相应的醛或酮。裂解产物HCN是生氰植物抵御微生物和食草动物攻击的有效武器,HCN还可以作为天冬酰胺生物合成途径中的氮源。重要的是,羟氰裂解酶的逆反应可以用非天然手性的HCN和相应的醛或酮合成具有手性的氰醇。手性氰醇是一些药物、农药和化学试剂合成途径中的重要中间体,目前很难通过一般的化学方法合成。从拟南芥(Arabidopsis thaliana)体内得到的羟氰裂解酶(AtHNL)是目前发现的第一个含有α/β-水解酶折叠结构的R选择性羟氰裂解酶。AtHNL的发现打破了人们普遍认为的只有S选择性羟氰裂解酶才具有α/β水解酶折叠结构的的观点。AtHNL主要催化R手性中心氰醇的裂解反应,定点突变实验证明,His236、Ser81和Asp208对酶催化有着重要影响。虽然实验学家对AtHNL进行了大量的突变及实验研究,但是AtHNL的具体催化反应机理还不明确。针对AtHNL的催化反应机理主要有两种,一种是Ser81亲核进攻机理,一种是广义酸碱催化机理,人们对AtHNL采用何种催化机理尚有争论。基于2012年得到的AtHNL的晶体结构,本文对AtHNL的催化机理进行了研究。本论文根据活性中心结构的不同构建了两个计算模型,提出了两条可能的反应路径。结果表明,AtHNL的催化反应采用广义酸碱催化机理,由于计算得到的路径A和路径B的自由能能垒相似,并且都与实验值符合较好,因此,这两条反应路径都是可行的。在催化反应中,催化三联体(His236, Ser81和Asp208)作为广义的酸碱起重要的催化作用,His236作为质子的供体与受体,Ser81作为质子的传递者。反应中生成的氰根离子主要被残基Ser81上的羟基和Ala13、Phe82主链上的氨基所稳定,这些研究结果可为其生物催化HCN的合成提供一定的理论指导。(3)甲基鸟氨酸合成酶(Py1B)催化机理研究。吡咯赖氨酸是目前人们发现的由自然遗传密码编译的第22种氨基酸,吡咯赖氨酸的发现极大的增加了蛋白质结构的多样性。在所有已知的甲胺合成甲烷的生物途径中,都需要毗咯赖氨酸的存在。实验证明,吡咯赖氨酸中的碳原子和氮原子皆来源于赖氨酸。在赖氨酸生物合成毗咯赖氨酸的途径中涉及到甲基鸟氨酸合成酶(Py1B),它属于自由基SAM依赖酶,主要利用自由基机理催化(2S)赖氨酸转化生成为(2R,3R)-3-甲基鸟氨酸。反应中,L-赖氨酸的S手性中心被反转为甲基鸟氨酸中的R手性。PylB的催化反应机理涉及到赖氨酸的碎片重排变位反应。本文利用了量子力学和分子力学相结合的QM/MM方法研究了甲基鸟氨酸合成酶的催化机理。结果表明,整个催化反应由七步基元反应构成,其中赖氨酸Cα-Cβ键的均裂和甘氨酰基自由基与氨基丁烯的结合都对应较高的反应能垒(分别为23.0kcal/mol和24.1kcal/mol),都决定了整个催化反应的速率,反应中产生的氨基丁烯碎片在活性中心内的旋转可以很好的解释最终产物的立体选择性。本论文的计算结果不仅很好的解释了实验现象,还可为自由基反应机理的进一步研究提供参考。(4)1,2-环己二酮水解酶(CDH)催化机理研究。硫胺素焦磷酸(ThDP)是维生素B1的生物活性代谢产物,是许多酶的重要辅因子,在许多体内代谢过程中起着重要作用,是维持消化系统、神经系统和心脏的正常运转不可或缺的物质。1,2-环己二酮水解酶(CDH)是2011年发现的一类ThDP依赖酶,它是脂环醇类化合物的α-双酮生物降解途径中所必需的酶。脂环醇类化合物是自然界中广泛存在的二级代谢产物,它们是合成一些化工产品的重要中间体,可以用来合成杀虫剂和除草剂。在脂环醇类化合物的a-双酮生物降解途径中,CDH主要催化1,2-环己二酮(CDO)水解生成6-氧代己酸。CDH是目前发现的第一个a-酮醇酶和第一个涉及到脂环醇类化合物碳-碳键断裂开环反应的ThDP依赖酶。虽然人们已经用实验方法对CDH的催化反应进行了研究,但是它的催化反应机理还不明确。本文利用QM/MM方法对CDH的催化机理进行了研究。由于1,2-环己二酮在溶剂中以一水化酮的形式存在,根据CDO不同的质子化状态,本论文构建了三种反应模型。在模型A中,整个催化反应通过五步基元反应来完成,其中C1(CDO)-C2(ThDP)键的断裂对应较高的反应能垒(19.9kcal/mol),为整个催化反应的决速步。在模型B和Bl中,只有模型B能够导致CDO转化为6-氧代己酸,相应的催化反应包括三个基元步骤。本论文的计算结果显示CDO的去质子化状态可以有效的促进底物分子C-C键的断裂。本论文对CDH进行的理论研究可以更好的帮助人们理解CDH及其他ThDP依赖酶的催化性能。(5)人类去泛素化酶(AMSH-LP)催化机理研究。泛素分子是所有真核细胞中都存在的一种小型蛋白质,它可以通过其末端残基连接到目标蛋白上来对蛋白质分子进行翻译后修饰。与其它翻译后修饰一样,泛素化过程也是可逆的。去泛素化酶(DUB)主要催化多聚泛素链中异肽键的水解反应,以此来调节和控制细胞中的去泛素化过程。虽然科学家们对DUB进行了一些实验研究,但其催化机理目前还不清楚。人体内去泛素化酶AMSH-LP专一性的催化裂解Lys63-连接多聚泛素链中的异肽键。并表现出一定的金属锌离子依赖性。本文利用量子力学和分子力学相结合的QM/MM方法对人类去泛素化酶AMSH-LP的催化机理进行了研究。计算结果表明,Zn2+配体水分子的活化过程对于异肽键的水解反应是必须的,羟基的亲核进攻过程要先于Lys63氨基的质子化过程。Zn2+在反应中除了作为路易斯酸之外,还可以通过调节它的配位环境来影响反应进程,这些研究结果可为探索去泛素化酶的生物学应用奠定一定的理论基础。本论文的特色和创新之处1)利用QM/MM方法系统研究了7-羧基-7-脱氮鸟嘌呤合成酶的催化机理,确定了底物分子的闭环反应是通过一个桥键中间体完成的,排除了开环中间体机理。通过比较钠镁离子对酶活性中心结构和对反应路径能垒的影响,解释了钠、镁离子在反应中所起的作用,给出了自由基SAM依赖酶催化的一般规律,为今后对自由基SAM酶催化反应的进一步研究提供了理论基础。2)利用QM/MM方法对R-羟氰裂解酶(AtHNL)的广义酸碱催化机理进行了研究。在研究中充分考虑了周围残基对反应的影响,通过势能面扫描确定了反应中最可能的反应路径及反应细节,解释了催化三联体(His236, Ser81和Asp208)在催化反应中的作用,研究结果对于手性氰醇生物合成具有指导意义。3)使用QM/MM方法对人类去泛素化酶(AMSH-LP)的催化机理进行了理论研究,确定了水分子的活化过程对于异肽键的水解反应是必需的,给出了Zn2+对催化反应调控的调控本质,确定了去泛素化酶催化异肽键水解反应的具体路径,并对相关残基的作用进行了详细说明,此研究对于深入理解泛素化酶的生物学功能具有一定的理论价值。