背景:奥氮平(OLZ)是临床使用最频繁的抗精神病药物之一,但其具有较高的代谢综合征风险,流行病学和动物实验均表明,奥氮平能引起机体代谢异常,特别是体重增加及糖脂代谢紊乱等。尽管奥氮平引起的代谢异常具有高度的临床相关性,却缺乏评估代谢异常与精神分裂症表型之间关系的研究,关于精神分裂症疾病本身及抗精神病药物奥氮平对机体代谢异常的影响值得关联着去研究,进一步阐明奥氮平引起体重增加的具体机制。体重增加是由于能量摄入与消耗失衡所致,而机体产热是影响能量消耗的关键因素。棕色脂肪组织,是哺乳动物和人体内非颤栗产热的主要来源,对于维持机体的体温和能量平衡起着重要作用,棕色脂肪细胞的线粒体有一种称为解耦联蛋白1(UCP1)的物质,这种物质使得葡萄糖和脂肪酸分解产生的化学能转化为热能。UCP1作为棕色脂肪组织产热的关键因子,其表达主要受调控因子PPAR-γ、PGC-1α、PRDM16和AMPK等的调节作用,但目前奥氮平导致的体重增加与棕色脂肪产热关系的研究较少报道,相关机制也还需进一步研究。目的:利用poly I:C诱导的精神分裂症动物模型及正常发育动物结合C3H10T1/2间充质干细胞定向分化的棕色脂肪细胞模型,考察不同生理条件下,奥氮平对棕色脂肪产热和棕色脂肪细胞发育分化的影响,解析奥氮平对能量代谢影响的分子机制,为临床抗精神病药引起的体重增加副作用提供理论基础。方法:1.选用成年雌性大鼠8只和雄性大鼠2只,分为2笼(4只雌性+1只雄性),雌鼠受孕后第一天记为妊娠期第1天(Gestational day 1,GD1)。在GD13天时对孕鼠腹腔注射聚肌胞苷酸(poly I:C,10 mg/kg)或等量的生理盐水(saline)。在GD15天时经眼眶采血(总血样<1.5 mL),酶联免疫吸附法检测血清中IL-6、CXCL1炎症因子的表达。然后将孕鼠后代饲养至56天时进行行为学检测(1%蔗糖偏好测试和强迫游泳测试)评估后代神经发育情况。2.将行为学结果符合要求的后代大鼠随机分为4组(每组12只,雌雄各半):(i)Veh(Saline);(ii)OLZ(Saline);(iii)Veh(Poly I:C)和 OLZ(Poly I:C)。训练大鼠自主口服空白糖丸7天。之后连续给药28天,OLZ(Saline)和OLZ(Poly I:C)组给予奥氮平(1.0 mg/kg/day,tid),Veh(Saline)和 Veh(Poly I:C)组给予等量空白糖丸;给药期间每4天检测大鼠体重和进食量,于第2和第4周检测大鼠肩胛处温度,给药结束后执行耐寒性测试。3.给药结束后经腹主动脉采血,用试剂盒检测血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C及NEFA的含量变化;获取棕色脂肪和白色脂肪并称重,切片进行HE染色和油红染色。4.用成脂分化液将C3H10T1/2细胞定向分化为棕色脂肪细胞,采用油红染色,免疫荧光及线粒体探针检测C3H10T1/2细胞分化后脂滴的形成,UCP1的表达及线粒体的含量,评估棕色脂肪细胞模型。5.使用MTT法筛选合适浓度的奥氮平,作用于C3H10T1/2细胞成脂分化期;并使用β3肾上腺素受体激动剂(CL316243)/cAMP激动剂(Forskolin)作用于成熟的棕色脂肪细胞,探究奥氮平对棕色脂肪细胞产热影响的可能机制。6.采用Western Blot及RT-PCR法检测孕鼠后代中棕色脂肪组织及棕色脂肪细胞产热相关蛋白和基因的变化。结果:1.Poly I:C诱导的精神分裂症模型与注射saline的孕鼠相比,poly I:C孕鼠血清中炎症因子IL-6(860.3±18.91 mmol/L vs.144.7±10.26 mmol/L,p<0.001)和趋化因子 CXCL1(4349±167.1 mmol/L vs.599.3±18.6 mmol/L,p<0.001)水平显著升高。在saline/poly I:C孕鼠成年后代的行为学测试结果显示:与saline孕鼠后代相比,poly I:C孕鼠后代糖水偏好率明显降低(62.52±0.5754 vs.80.73±0.6316,p<0.001)。同时在水中静止不动的时间显著增加(167.4±4.343 vs.99.22±3.407,p<0.001)。说明poly I:C孕鼠后代比saline孕鼠后代具有明显的快感缺乏与绝望行为,精神分裂症模型建立成功。2.奥氮平对poly I:C孕鼠后代体重、摄食及血脂的影响在没有奥氮平干预的情况下,与大鼠神经发育正常的Veh(Saline)组相比,精分模型Veh(Poly I:C)组体重增长明显,但不具显著性,而后者的累积摄食量却明显低于前者(504.25±37.79 gvs.534.51±16.50 g,p<0.001);结合大鼠生理状态和奥氮平干预分析时,与Veh(Saline)组相比,OLZ(Saline)组体重增长显著(295.44±14.25 g vs.276.22±21.13 g,p<0.01),累积摄食量无显著变化;与Veh(PolyI:C)组相比,OLZ(PolyI:C)组体重增长显著(333.11±11.42gvs.284.56±19.66 g,p<0.001),且累积摄食量也显著上升(576.58±26.67 gvs.504.25±37.79 g,p<0.05)。与 Veh(Saline)组相比,Veh(Poly I:C)组 TG 水平(0.827±0.294 mmol/L vs.0.343±0.058 mmol/L,p<0.001)和 pWAT 重量显著升高(10.4±0.6 g vs.7.3±0.4g,p<0.001)。TC、LDL-C、NEFA均上升,HDL-C下降,但未表现出显著性;与 Veh(Saline)组相比,OLZ(Saline)组 TC 水平(1.653±0.334 mmol/L vs.1.233±0.062 mmol/L,p<0.01)和 NEFA 水平(471.883±39.160 mmol/L vs.318.943±50.569 mmol/L,p<0.05)显著上升。TG、LDL-C 和 HDL-C 水平无显著变化;与 Veh(PolyI:C)组相比,OLZ(PolyI:C)组 TG 水平(1.105±0.356 mmol/Lvs.0.827±0.294 mmol/L,p<0.05)和 NEFA 水平(467.26±36.383 mmol/Lvs.368.043±61.557 mmol/L,p<0.05)显著上升。TC、LDL-C 和 HDL-C 无显著变化。3.奥氮平对poly I:C孕鼠后代棕色脂肪产热与脂质堆积的影响肩胛处温度检测和耐寒性测试结果显示,与Veh(Saline)组相比,Veh(Poly I:C)组肩胛处温度和自适应产热均降低,但无显著性差异。组织切片染色显示,Veh(Poly I:C)组WAT体积增大且棕色脂肪密度减小;与Veh(Saline)组相比,OLZ(Saline)肩胛处温度显著降低(29.1±0.4℃ vs.30.9±0.3℃,p<0.001),寒冷刺激下大鼠温度更低,但无显著性差异;OLZ(Poly I:C)组较Veh(Poly I:C)组肩胛处温度显著降低(29.0±0.5℃ vs.30.5±0.4℃,p<0.05),且奥氮平处理过的组白色脂肪细胞体积明显增大,甘油三酯聚积,棕色脂肪形态发生改变,密度变小且脂滴增大。4.奥氮平对poly I:C孕鼠后代棕色脂肪产热相关蛋白和基因转录水平的影响Western Blot结果显示,未经奥氮平处理的模型鼠与正常鼠的UCP1表达并无显著变化;与Veh(Saline)组相比,OLZ(Saline)组UCP1和PPAR-γ分别显著降低了～54.9%和～63.2%;与 Veh(Poly I:C)组相比,OLZ(Poly I:C)组 UCP1、PPAR-γ、PRDM16均显著降低,降低水平分别为～56.5%、～25.3%和～73.8%。RT-PCR结果显示,与Veh(Saline)组相比,Veh(PolyI:C)组Ucp1转录水平下调了～12.8%,同时其上游调控因子和脂肪酸氧化相关基因如:Ppar-γ、Prdm16、Pgc-1α、、Acc1和Hsl的转录水平均显著下调;与Veh(Saline)组相比,OLZ(Saline)组Ucp1及其调控因子和脂肪酸氧化相关基因(Ppar-γ、Prdm16、Pgc-1α、Acc1、Hsl和Cpt-1β)的转录水平均显著下调,其中Ucp1下调达～70.1%;与Veh(Poly I:C)组相比,OLZ(PolyI:C)组Ucp1显著下调～67.0%,并伴随着Ppar-γ、Prdm16、Pgc-1α、Acc1、Hsl和Cpt1β转录水平的显著下调。5.奥氮平对C3H10T1/2细胞分化为棕色脂肪细胞的影响奥氮平(1 μM和10 μM)能抑制C3H10T1/2细胞定向分化为棕色脂肪细胞,显著下调了 UCP1(～5%和～27%,p<0.05)、PGC-1α、PPAR-γ、PRDM16、AMPK和p-AMPK的蛋白水平,同时Ucp1的转录水平(～25.6%和～80.2%,p<0.05)及棕色脂肪细胞中线粒体生物合成和脂肪酸氧化相关基因Cox4、Cpt-1β、Pdk4、Dio2和NE-R也都呈现出显著下调的趋势;此外,奥氮平(1μM和10 μM)能显著降低棕色脂肪细胞线粒体含量(～13.9%和～22.9%,p<0.05)和线粒体膜电位(～11.6%和～19.6%,p<0.001),且具有浓度依赖作用。6.CL316243/Forskolin与奥氮平联合处理对棕色脂肪细胞的影响当C3H10T1/2细胞分化为成熟棕色脂肪细胞后,相比于对照组,用奥氮平(10μM)处理 2h后Ucp1的转录水平显著下降～66.4%(p<0.001),Pka、Ampk、Ppar-γ转录水平均也都显著下降。引入CL316243处理45 min后,CL316243+奥氮平组Ucp1的转录水平较CL316243单独处理组增加了～55.5%(p<0.05),Ampk转录水平也产生了负反馈调节地显著增加;相比于奥氮平单独给药组,CL316243+奥氮平组Ucp1的转录水平增加了～85.05%(p<0.01),Pka、Ampk、Ppar-γ转录水平均显著增加。此外,Forskolin处理45min后,共处理的Forskolin+奥氮平组较单独的Forskolin组Ucp1、Pka、Ampk、Ppar-γ的转录水平均显著降低,其中Ucp1降低了～12.4%(p<0.05),而相比于奥氮平单独给药组,Forskolin+奥氮平组Ucp1、Pka、Ampk及Ppar-γ的转录水平呈现升高趋势。结论:在poly I:C诱导的精神分裂症动物模型中,后代pWAT和TG显著增加,体重、TC、LDL-C水平也升高了,说明疾病模型下机体具有脂代谢异常的高风险,但与精神分裂症动物模型的自身代谢异常相比,奥氮平对机体的影响更严重。奥氮平在poly I:C模型后代中降低棕色脂肪的产热活性为体重增长和能量代谢失衡奠定了基础,这可能与抑制棕色脂肪中AMPK的激活相关。细胞水平上,奥氮平抑制C3H10T1/2间充质干细胞定向分化为棕色脂肪细胞,同时以浓度依赖性的方式下调棕色脂肪细胞中产热蛋白UCP1的表达和线粒体活性。奥氮平对棕色脂肪产热活性的调节可能涉及β3-AR-cAMP-PKA-AMPK-PPAR-γ-UCP1信号通路,这为阐明抗精神分裂症药物产生代谢性副作用的机制提供了实验证明和理论依据。