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雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook, f)系卫矛科(Celastraceae)雷公藤属植物,其化学成分复杂,具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗生殖等多种药理学活性。作为药物最早收载于《神农本草经》。1974年,首次将雷公藤内服用于治疗类风湿性关节炎并取得良好疗效。1981年,舒达夫等发现雷公藤醋酸乙酯提取物对类风湿性关节炎的近期疗效显著,总有效率92.26%。雷公藤内酯醇,一种从雷公藤分离出来的环氧二萜类化合物,是雷公藤发挥作用的主要物质成分之一,逐渐成为研究热点。临床上,雷公藤与激素类药物泼尼松交替配合应用于治疗类风湿性关节炎、哮喘、肾病综合征等,取得较好疗效。雷公藤见效虽然比激素慢,却持久稳定,且同时有抗炎、免疫抑制及类皮质激素作用,却无强的松的副作用,丰富或补充了皮质激素治疗的不足,两者阶段性交替用药是最佳的配伍。临床研究显示雷公藤与神经内分泌系统有关联,我们在前期的实验动物整体水平上,证实了雷公藤对下丘脑—垂体—肾上腺轴(hypothalamic pituitary adrenal axis,HPAA)具有促进作用。由于整体动物体内存在复杂的神经-内分泌-免疫调节网络内环境,难以准确阐明雷公藤对HPAA的确切作用环节及其抗炎和免疫调节作用机制。随着雷公藤的应用,对于其作用机制的研究已有较多的报道。雷公藤对气道平滑肌细胞、角膜成纤维细胞、神经星形胶质细胞均有作用,但其对离体大鼠肾上腺皮质细胞的作用尚未见报道。在体内实验,我们发现雷公藤可以很明显的促进大鼠肾上腺皮质酮的分泌和束状带细胞的增生。因此,本课题观察雷公藤内酯醇对体外培养的肾上腺皮质细胞的影响作用,为阐明雷公藤促进内源性皮质激素分泌的机制,为指导临床安全、合理、有效地使用雷公藤提供理论基础。第一部分雷公藤内酯醇药物血清的制备及肾上腺皮质细胞的培养与鉴定目的分离出大鼠肾上腺皮质细胞并进行原代培养。方法采用药物血清的方法培养离体的大鼠肾上腺皮质细胞,并对培养细胞进行组织化学鉴定。结果成功进行了大鼠肾上腺皮质细胞的分离和培养,经鉴定后确认为肾上腺皮质细胞。第二部分雷公藤内酯醇对培养的肾上腺皮质细胞的形态学影响目的研究雷公藤内酯醇对培养的肾上腺皮质细胞的形态学影响。方法采用免疫组织化学法观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达并计算PCNA阳性细胞数,透射电子显微镜观察肾上腺皮质细胞的超微结构。结果中、高剂量雷公藤内酯醇组PCNA阳性细胞比率高于对照组(P<0.05),泼尼松组低于对照组(P<0.05)。电镜显示:对照组肾上腺皮质细胞胞浆线粒体肿胀,线粒体嵴消失,光面内质网不多;泼尼松组线粒体肿胀,结构模糊,嵴消失,可见光面内质网;而各剂量雷公藤内酯醇组线粒体丰富,不肿胀,嵴清楚,含丰富的光面内质网。第三部分雷公藤内酯醇对培养的肾上腺皮质细胞的功能学影响目的研究雷公藤内酯醇对培养的肾上腺皮质细胞的功能学影响。方法酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清液中皮质酮水平;实时荧光定量聚合酶链式反应法检测肾上腺皮质细胞3β-羟基类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase,3β-HSD) mRNA表达水平。结果各个浓度雷公藤内酯醇药物血清组肾上腺皮质细胞培养上清液中皮质酮水平及细胞中3β-HSD mRNA表达水平较对照组明显升高,泼尼松组均低于对照组(P<0.05)。结论雷公藤和皮质激素均有抗炎及免疫抑制双重作用,可用于治疗多种自身免疫性疾病。临床研究发现,长期服用强的松虽能有效地控制病情,但是会抑制肾上腺皮质使血总皮质醇含量明显低于正常,导致不同程度的柯兴氏综合征表现,还可并发糖尿病,对机体危害较大。雷公藤多苷同时具有抗炎、免疫抑制及类皮质激素作用,却没有强的松的副作用,经雷公藤制剂治疗后,皮质激素能顺利撤除或大大减量,既可避免长期服用激素的副作用,又达到了有效的治疗目的。但是,究竟雷公藤的“类皮质激素抗炎作用”的机制何在以及它对机体内分泌的影响如何,目前仍缺乏足够的实验和临床研究资料,不利于指导临床进一步安全合理地使用该药。我们在前期的动物实验已经证实了雷公藤对HPAA具有促进作用。陈龙的研究结果表明,雷公藤提取物能促进大鼠肾上腺皮质尤其是束状带细胞核DNA的功能活性,具有刺激肾上腺皮质束状带细胞增生、分泌类脂质和皮质酮的功能。动物实验和临床治疗结果均支持雷公藤可以通过兴奋HPAA而促进肾上腺皮质功能,发挥其类皮质激素作用的抗炎效果这一观点。因此,本文采用体外细胞培养的方法,直接研究雷公藤内酯醇对离体大鼠肾上腺皮质细胞的作用,以排除垂体及下丘脑层面上的影响。本课题通过采用药物血清的方法研究雷公藤内酯醇对大鼠肾上腺皮质细胞的影响作用,运用多种实验方法从多角度证明雷公藤内酯醇可以促使肾上腺皮质细胞分泌皮质酮,而且显然与泼尼松的作用机制不同。结合前期的实验结果,从整体动物实验和体外实验两方面同时证实了雷公藤可以作用于HPAA,而且对肾上腺有直接的影响作用,说明了雷公藤的“类皮质激素抗炎作用”的机制,有利于进一步指导临床的药物使用。但雷公藤内酯醇是否仅对肾上腺有刺激作用从而对HPAA产生影响作用?我们拟今后继续采用体外组织细胞培养实验方法,研究雷公藤内酯醇分别对离体大鼠的下丘脑组织、垂体细胞的影响和作用机制,从多角度探讨雷公藤对HPAA作用的靶器官、靶组织和靶细胞及其类皮质激素样抗炎和免疫抑制作用机制。