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目的:通过检测粘着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)在左心室肥大心肌细胞中表达和定位的变化,说明FAK参与了心肌肥大时细胞信号的传递,心肌纤维合成与组装的调节,探讨FAK在高血压心室肥大发生发展机制中的作用。
方法:
1、实验动物选择:以2、6、12、18月龄的特发性高血压心衰(Spontaneously Hypertensive Heart Failure,SHHF)大白鼠为研究对象,按月龄分组,每月龄6只。相同月龄Wister-Kyoto(WKY)大白鼠作为对照组,按月龄分组,每月龄6只。
2、蛋白质分离、电泳和Western Blot方法:将左心室组织分别制成含有总蛋白、浆蛋白、膜蛋白和核蛋白的组织匀浆,检测FAK在不同月龄SHHF大白鼠左心室不同组织匀浆中的表达。
3、免疫荧光染色方法和共聚焦显微镜观察:采用对SHHF大白鼠左心室分离心肌细胞和左心室组织冰冻切片的免疫荧光标记,通过共聚焦显微镜观察FAK在心肌细胞亚细胞结构中的分布。
4、统计学分析:应用SPSS10.0统计学软件进行两组独立样本的t检验。P<0.05认为有显著性差异。
结果:
Western Blot结果显示:FAK在2月龄SHHF大白鼠心肌组织的表达与WKY大白鼠比较无显著性差别,但从6月龄开始,FAK在SHHF大白鼠心肌组织中表达明显增加,并且一直持续到12、18月龄。尽管FAK在2、6、12、18月龄SHHF心肌组织胞浆蛋白中的表达无明显变化;但是,FAK在SHHF大白鼠心肌组织膜蛋白和核蛋白中的表达,从6月龄开始也明显增加,并且一直持续到12和18月龄组。免疫荧光染色结果显示:2月龄时,实验组SHHF大白鼠与对照组WKY大白鼠心肌细胞中FAK荧光分布相似,即胞浆弥漫性绿色荧光,核内极弱的小颗粒点状荧光,膜上较弱的点状荧光颗粒。这一荧光分布特征在6、12、18月龄的WKY大白鼠心肌细胞中无明显变化,而在6、12、18月龄的SHHF大白鼠心肌细胞中,在细胞膜,尤其是细胞两端的闰盘上观察到FAK强的绿色线状荧光,核内亦出现明显的FAK的强荧光颗粒。
结论: SHHF大白鼠在6月龄时,心肌纤维横向性生长达到高峰,同时开始心肌纤维的纵向性生长,最终导致失代偿性心肌肥大及心力衰竭。免疫荧光染色和Western Blot结果均显示:从6月龄开始,在SHHF大白鼠左心室肥大心肌细胞中,FAK表达增加并出现向闰盘和细胞核内的聚集,并一直持续到12、18月龄。提示FAK可能参与了高血压所致的心肌重建和失代偿性心肌肥大形成过程。