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PGCs(Primordial germ cells,PGCs)是精子和卵子的祖细胞,能够将遗传信息从亲代传递给子代的干细胞,保证了种系间遗传物质的稳定传递。近年来,通过探究PGCs发生的具体过程,揭示生殖细胞发育过程中关键基因的分子作用及其机制已逐渐成为生殖生物学领域中的研究热点。研究PGCs分化具有重要意义:(1)对畜牧学而言,研究动物生殖干细胞分化过程有助于解决畜牧种质的选配选育问题;(2)对人类而言,详细了解生殖分化机理能够为不孕不育等疾病提供根本解决方法。然而无论是解决哪方面的问题,都需要建立在全面了解生殖过程中细胞发育事件和相关基因作用机制的基础上,只有这样才能从根本上解决畜牧学和人类生殖相关性状的相关问题。然而,目前由于对PGCs的发育调控机制缺乏深入探索,导致体外诱导效率低下,难以获得数量多且质量高的PGCs,极大的限制了 PGCs的利用;因此,亟需对PGCs的发生发育机理进行深入的研究。基于此,本课题组前期已经对体内正常发育过程中的胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)、PGCs 和精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)进行了全基因组转录组测序,发现了一些影响PGCs形成的关键基因和关键信号通路,而C2EIP(Chromosome 2,Expression In PGCs)就是其中一个最具有显著性差异表达的关键基因;C2EIP在PGCs中高表达,而在ESCs和SSCs中低表达,推测该基因可能参与了 PGCs的发育调控。为了系统的研究C2EIP基因的功能。本研究中,我们以家鸡为研究对象探索C2EIP在PGCs形成过程中的功能;利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究C2EIP基因的作用以及研究C2EIP在不同细胞中差异表达的影响因素;利用GST-PullDown,质谱分析,免疫共沉淀等实验技术研究C2EIP的分子调节机制。研究结果如下:(1)C2EIP的发现、克隆及生物信息学分析对ESCs、PGCs和SSCs的转录组测序结果进一步分析发现C2EIP在PGCs中特异高表达,在ESCs和SSCs中不表达,RT-PCR验证结果与转录组测序结果一致;生物信息学预测结果发现C2EIP主要在细胞质中表达,存在磷酸化和糖基化位点;C2EIP CDS序列在不同物种间保守型较差,禽类中保守性较高;C2EIP具有泛素化连接酶E3和磷酸化雷帕霉素靶蛋白复合体功能,初步推断C2EIP行使类似酶的功能;(2)CRISPR/Cas9基因编辑技术介导家鸡C2EIP敲除体系建立根据NCBI数据库提供的C2EIPCDS序列,设计3个gRNA靶位点,命名为gRNA1,gRNA2,和gRNA3并连入改造后的VK001-08载体中,通过SSA活性检测发现gRNA3对靶位点的敲除活性(Value:0.6924±0.07)是对照组(Value:0.3724±0.12)的近 2 倍(P<0.01),但 gRNA1(Value:0.3813±0.27)和gRNA2(Value:0.3718±0.09)对相应靶位点的敲除活性与对照组(Value:0.3912±0.32)之间相比没有差异(P>0.05),即没有敲除活性;将CRISPR/Cas9-gRNA3转染生长状态良好的DF-1细胞后提取DNA,通过T7E1酶切检测发现gRNA3在DF-1细胞中对C2EIP的敲除效率为27%,TA克隆测序结果表明30个测序菌液中有8个菌液出现不同数目的碱基缺失或增加,初步估计基因敲除效率为26%;将CRISPR/Cas9-gRNA3转染生长状态良好的ESCs后进行T7EI酶切检测发现敲除效率为20%,同时CRISPR/Cas9-gRNA3能够在鸡胚中顺利表达并在心脏表达水平最高,且载体在鸡胚中整合后基因敲除效率达15%;(3)体内外研究C2EIP在PGCs形成过程中的功能克隆C2EIPCDS全长,并成功构建PCDNA3.0-C2EIP过表达载体和C2EIP-N1融合表达载体;C2EIP-N1融合表达载体转染DF-1后观察绿色荧光蛋白表达位置,发现C2EIP在细胞质中表达;针对C2EIPCDS序列,设计抗原表位,合成多肽并腹腔免疫小鼠制备单克隆抗体,IFA检测抗体效价为1:10,且抗体抗原反应也发生在细胞质中;通过体内和体外两个水平研究C2EIP在PGCs形成过程中的功能,结果发现:体外实验过程中,在过表达组诱导6天后能出现生殖样细胞,且生殖标记基因有显著性的上调表达(P<0.01),敲除组在相同的情况下则不能。流式细胞分选结果表明基因敲除后CVH阳性细胞数量减少(4.8±0.16%),过表达反而增加(18.6±0.13%),荧光定量实验结果也显示C2EIP敲除后PGCs的标记基因Cvh的表达(Value:2.8254±0.31)与正常组(Value:3.1425±0.66)相比出现了显著的下调(P<0.01);体内实验过程中,注射过表达载体后的鸡胚发育与对照相比没有显著差异,但是在第4.5天Cvh的表达显著提高(P<0.01)。对4.5天的鸡胚进行冰冻切片后利用Cvh和C-KIT特异抗体进行免疫组化实验,结果表明注射敲除载体后产生的PGCs数量显著的低于正常发育组和注射过表达载体的实验组。正常组和过表达组中肾发育完全可见,而在敲除组中无法观察到完整的中肾结构;(4)探索影响C2EIP差异表达的因素克隆C2EIP启动子序列并连入EGFP-N1载体构建PC2EIP-EGFP表达载体,瞬时转染DF-1后可以观察到EGFP绿色荧光,这就说明克隆的C2EIP启动子区域具有启动活性;通过5’端逐步缺失技术克隆C2EIP启动子不同长度片段,并构建PGL3/787(-891～-94bp)、PGL3/588(-682～-94bp)、PGL3/374(-468～-94bp)、PGL3/170(-264～-94bp)载体,并通过双荧光素酶报告系统发现C2EIP启动子核心区域为-264～-94bp;对启动子核心区域进行转录因子结合位点预测发现STAT1、STAT10、Sox17、Sox2和Klf5转录因子结合位点,对这些位点进行点突变实验同时构建相应转录因子过表达载体,通过双荧光素报告系统检测发现STAT1能够正向调节C2EIP启动子活性;STAT10,Sox17,Sox2和Klf5负向调节C2EIP启动子活性;在转染了 PGL3/787载体的DF-1细胞的培养基中分别添加TSA和5Azacd,双荧光素报告系统检测结果表明:降低DNA甲基化水平和提高组蛋白乙酰化水平能够提高C2EIP启动子活性;(5)研究C2EIP调节PGCs形成过程的分子调控机制构建C2EIP的原核融合表达载体,并进行IPTG诱导表达和纯化,C2EIP原核融合表达载体能够在原核表达菌株中顺利表达;通过GST-PullDown和质谱分析成功获取与C2EIP蛋白的互作蛋白,分别是:PTCH2,KRT75,H2B-Ⅷ,KRT12,Histone H3,SLC25A6,LYZ,VDAC2,Histone H1,EF-1α,KRT19;通过Western Blot,Co-IP和间接免疫荧光验证了 GST-Pull Down互作的准确性并确认C2EIP与PTCH2蛋白在细胞内膜发生互作形成复合物;通过Co-IP技术对体外和体内不同C2EIP处理下的PTCH2进行沉淀并通过Western Blot检测PTCH2的磷酸化和泛素化水平变化,结果发现:高表达C2EIP能够降低PTCH2蛋白的磷酸化水平和降低PTCH2蛋白泛素化水平;成功构建PTCH2干扰表达载体 shRNA-PTCH2-1,shRNA-PTCH2-2,shRNA-PTCH2-3;同时验证出shRNA-PTCH2-3对PTCH2蛋白具有较好的抑制效果;通过体内和体外验证实验发现:抑制 HH 信号通路能够抑制 PGCs 的形成(RA:3.8±0.23%;RA+shRNA-IHH:12.9±0.08%;P<0.01),反之,激活HH信号通路则能够促进PGCs的形成(RA:3.8±0.23%;RA+shRNA-pTCH2:15.6±0.17%;P<0.01),结合上述实验结果分析发现 IHH 与 PTCH2 蛋白结合,改变PTCH2活性成分表达水平从而调节HH信号参与PGCs形成,而C2EIP也可以与PTCH2结合并通过泛素化和去磷酸化修饰改变PTCH2蛋白的活性成分表达水平,因此可以推断C2EIP与通过PTCH2激活HH信号通路,调节PGCs的形成。