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慢性应激对大鼠学习记忆的损伤及其机制研究背景:当今社会竞争日益激烈,人们长期处于紧张、焦虑、压力过大等应激状态,严重损害机体内平衡从而易引发各种生理心理疾病,因此应激对健康的影响越来越受到人们关注。应激可能诱发多种疾病的发生,其中包括影响大脑的认知功能和导致精神疾病。但目前重复应激对大鼠学习记忆功能的损伤、海马结构和功能的影响尚不完全清楚。目的:研究重复束缚应激对大鼠学习记忆功能的损伤以及其潜在的机制。方法:3周龄SD雄性大鼠被随机分为两组,对照组不给予任何处理,重复应激组给予连续7天,每天2 h的束缚应激。应激结束后,立即进行行为学检测。为探究学习记忆功能受损机制,我们进行离体脑片或离体脑片给予NMDAR抑制剂AP-5、Glu N2A选择性抑制剂PEAQX和Glu N2B选择性抑制剂Ro25-6981预孵育,采用电生理检测LTP或LTD;Golgi染色检测树突棘密度;采用western检测突触相关蛋白的表达。最后,对大鼠重复应激处理前在其CA3区定位注射Ro25-6981,检测行为学变化。结果:1、重复应激导致SD大鼠认知功能障碍:在水迷宫训练阶段的第四轮和第五轮,重复应激组大鼠找到逃逸平台的潜伏期分别为29.7 s和25.8 s,和对照组大鼠潜伏期(分别是17.8 s和15.8 s)相比明显增加。在第五轮训练结束后,撤掉逃逸平台进行记忆能力的检测,重复应激组大鼠第一次找到逃逸平台的潜伏期为24.6 s,显著高于对照组大鼠的15.1 s;重复应激组大鼠在放有逃逸平台的目标象限滞留的时间为17.3 s,低于对照组大鼠的26.5 s;且60 s内穿越平台的平均次数为1.8次,明显少于对照组的3次。在旷场实验中,和对照组相比,重复应激组大鼠自主探索中心开阔区域的时间百分比为13.0%,与对照组大鼠的12.9%并没有显著性差异,说明7天的重复应激没有使大鼠产生抑郁样行为学改变。在新异物体识别实验的训练阶段,重复应激组大鼠对新异物体和熟悉物体的探索时间的百分比与对照组大鼠基本一致;在检测阶段,重复应激组大鼠探索新异物体的时间百分比为17.9%,比对照组大鼠的探索时间40.3%明显减少。同样的,在条件恐惧实验的训练阶段,重复应激组大鼠与对照组大鼠对于电击的僵直反应基本相同;训练阶段给予电击后,重复应激组的僵直时间比率为18.5%,与对照组19.8%基本持平;而在检测阶段,重复应激组大鼠的僵直时间比率为31.4%,则显著低于对照组的41.8%。2、重复应激引起大鼠海马LTP下降(对照组增强幅度为1.65,应激组幅度为1.17;引起大鼠海马LTD易化(对照组抑制幅度为1.02,应激组幅度为0.68)。3、重复应激造成大鼠海马CA3区树突棘密度下降(对照组为12.04/10μm,应激组为8.18/10μm);4、重复应激增加大鼠海马CA3区Glu N1、Glu N2A、Glu N2B等突触蛋白的表达并促使突触蛋白在膜上的分布增加;5、重复应激对于大鼠海马神经元数量没有明显影响;6、离体脑片孵育AP-5阻断重复应激组大鼠LTD的诱导(对照组抑制幅度为1.02,应激组幅度为0.68,应激孵育组幅度为0.98),但未能逆转LTP的下降(对照组增强幅度为1.66,应激组幅度为1.21,应激孵育组幅度为1.11);7、离体脑片孵育Ro25-6981阻断重复应激组大鼠LTD的诱导(对照组抑制幅度为1.01,应激组幅度为0.66,应激孵育组幅度为0.96);8、大鼠CA3区注射Ro25-6981逆转重复应激引起的认知功能障碍:在新异物体识别实验中,重复应激合并给予Ro25-6981组大鼠对新异物体和熟悉物体的探索时间比率分别为263.875 s和119.213 s,相比对照组大鼠的探索时间231.288s和109.137 s,没有显著差异。在场景恐惧实验中,训练阶段对照组和重复应激给药组的僵直时间比率分别为21.9375%和21.9%;检测阶段,对照组和重复应激给药组僵直时间比率分别为57.575%和60.3875%。结论:重复应激造成大鼠海马CA3区NMDAR表达增加并在膜上异常聚集,引起突触可塑性受损和学习记忆障碍,而抑制包含Glu N2B的NMDA受体可以逆转重复应激导致的突触可塑性损伤和认知功能障碍。极低频率磁场暴露改善AD模型鼠认知功能及其机制研究背景:阿尔兹海默病(AD)是一种渐进性的神经退行性疾病,并且是引起老年性痴呆的最常见的原因。AD的神经病理学标志是淀粉样斑块(β-amyloid),神经原纤维缠结和神经变性,其中神经变性最终会导致痴呆。过度磷酸化的微管相关蛋白tau是神经原纤维缠结的主要蛋白成分。伴随着AD病理进程的发展,患者开始出现突触功能的损伤和神经元丢失。虽然早已有研究显示,AD病人脑中神经元纤维缠结的数量与痴呆的程度正相关,但是却一直缺乏有效的治疗手段。极低频率电磁场是电场和磁场的混合。极低磁场的频率范围在1 Hz到300Hz。近几十年来,由于人们接触到ELF-MF暴露越来越频繁,因此其与人类健康之间的关系已经成为研究热点。有研究报道,极低频率电磁场对于某些神经退行性疾病如亨廷顿病,帕金森病有一定的改善效果。本课题组前期研究结果显示,在AD的早期阶段进行为期3月的50 Hz,500μT的ELF-MF暴露,可以通过减少神经元丢失和减少氧化应激反应来有效延缓AD的病理进程。在开始进行ELF-MF干预时3×Tg AD模型鼠的病理改变如tau蛋白磷酸化和Aβ沉积等尚未显著发生。那么,对于已经发展到严重认知障碍的阶段,ELF-MF暴露,是否仍然可以逆转认知功能,延缓病理进程呢?本次实验,我们给予12月龄的3×Tg AD小鼠50 Hz,500μT连续一个月的ELF-MF暴露,并在暴露结束后应用动物行为学,生化与分子生物学实验技术以及电生理技术来评估ELF-MF暴露对于3×Tg AD小鼠认知功能障碍的改善作用并探究其潜在的分子机制。目的:研究极低频率电磁场对12月龄3×Tg AD小鼠学习记忆功能的改善和潜在机制方法:12月龄的实验小鼠被随机分为4组:野生型标准环境暴露对照组(WT-SE),野生型极低频率电磁场暴露组(WT-MF),转基因型标准环境暴露组(3×Tg-SE),转基因型极低频率电磁场暴露组(3×Tg-MF),所有小鼠接受一个月的标准环境或极低频率电磁场暴露处理。处理结束后,采用行为学检测小鼠认知功能,采用离体脑片电生理检测长时程增强(LTP),采用高尔基染色检测小鼠海马神经元树突棘密度,采用蛋白免疫印迹(westernblotting)检测小鼠海马tau蛋白磷酸化和突触相关蛋白表达,采用免疫组化检测大脑中Aβ含量。结果:1、ELF-MF暴露改善了12月龄3×Tg AD小鼠的学习记忆功能障碍:在水迷宫检测中,野生型标准环境暴露对照组(WT-SE),野生型极低频率电磁场暴露组(WT-MF),转基因型标准环境暴露组(3×Tg-SE),转基因型极低频率电磁场暴露组(3×Tg-MF)小鼠在目标象限滞留时间分别为22.7 s、28.0 s、16.9s、21.4 s;WT-SE组、WT-MF组、3×Tg-SE组、3×Tg-MF组小鼠找到逃逸平台的潜伏期分别为18.6 s、17.6 s、29.0 s、19.8 s;WT-SE组、WT-MF组、3×Tg-SE组、3×Tg-MF组小鼠穿越目标平台的次数分别为2.8 s、3.2 s、1.4 s、2.4 s。在场景相关条件恐惧实验检测中,WT-SE组、WT-MF组、3×Tg-SE组、3×Tg-MF组小鼠的僵直比率分别为59.8 s、68.5 s、36.4 s、53.7 s;在线索相关条件恐惧实验检测中,WT-SE组、WT-MF组、3×Tg-SE组、3×Tg-MF组小鼠的僵直比率分别为67.1 s、71.4 s、40.6 s、54.1 s。在筑巢实验中,WT-SE组、WT-MF组、3×Tg-SE组、3×Tg-MF组小鼠的筑巢得分分别为4、3.8、2.5、4。2、ELF-MF暴露增强3×Tg AD小鼠海马LTP(WT-SE组、WT-MF组、3×Tg-SE组、3×Tg-MF组小鼠的增强幅度分别为1.48、1.53、1.13、1.42);3、ELF-MF暴露增加了3×Tg AD小鼠海马神经元树突棘密度(WT-SE组、WT-MF组、3×Tg-SE组、3×Tg-MF组小鼠的树突棘密度分别为9.9/10μm、9.8/10μm、7.1/10μm、9.4/10μm);4、ELF-MF暴露使3×Tg AD小鼠海马突触相关蛋白的表达得到增加;5、ELF-MF暴露使3×Tg AD小鼠大脑中Aβ水平降低;6、ELF-MF暴露降低了3×Tg AD小鼠海马中tau蛋白磷酸化水平。结论:一段时间的ELF-MF暴露改善了12月龄AD模型鼠的认知障碍,增强海马突触可塑性,并减轻AD的病理进程,说明ELF-MF暴露对于阿尔兹海默病有一定的治疗作用。