研究背景前列腺癌是西方国家男性最常见的恶性肿瘤之一,是引起美国男性死亡的第二大癌症。我国男性前列腺癌发病率要低于西方国家,但随着人口老龄化和生活条件的改善,我国男性的前列腺癌发病率也越来越高,呈明显上升趋势。前列腺癌发病机制的研究一直是肿瘤研究的热点问题。前列腺癌是一种雄激素依赖的恶性肿瘤。目前认为,雄激素在前列腺癌的生长、转移和分化中起重要作用。雄激素受体信号通路的研究也极大地提高了我们对前列腺癌发生的认识,从而导致了雄激素剥夺疗法在前列腺癌治疗中的成功发展。然而,经过一段时间雄激素剥夺治疗后,前列腺癌患者病情通常会进入停滞期,对于治疗变得不敏感,继而转变成雄激素非依赖型的前列腺癌,最终导致转移和死亡。因此,雄激素受体信号通路的机制并不能完全解释前列腺癌的发生发展过程,这表明还存在其他导致前列腺癌发生发展的过渡和替代机制。自从雄激素剥夺疗法发展以来,前列腺癌的药物研究进入了一个瓶颈期。研究表明,除了雄激素受体信号通路外,PI3K/Akt等信号通路同样也参与前列腺癌的形成,但从这些研究结果中并未发现有效的治疗药物。随着上世纪80年代早期催化性RNA的发现,研究者们意识到,RNAs不只是一个介于DNA和蛋白质之间的中间产物,而是一个动态的、多功能的分子,它调节各种细胞过程的功能,包括癌症发生。这些发现最终导致了基于RNA的疗法的出现,这大大拓宽了药物开发的范围。目前我们对前列腺癌发生发展的认识主要是基于对蛋白质编码基因的研究,针对非编码基因在前列腺癌发生发展中作用的研究还有很大的认识空间。长链非编码RNAs(lncRNAs)是一类长度超过200个碱基长度的非编码RNA,本身不编码蛋白质的产生。lncRNAs由基因组DNA通过转录剪接而成。基因组编码大量的lncRNAs,但是关于它们在生物体内的功能却知之甚少。近年来,越来越多的研究表明,lncRNAs参与多种细胞活动,包括胚胎发育、细胞生长、分化以及代谢等生理过程。此外,研究发现,多种lncRNA在前列腺癌患者体内发生异常表达,表明lncRNA可能参与了前列腺癌的发生发展过程,起到了促癌或抑癌的作用。例如,lncRNAPCA3(prostate cancer antigen 3)在良性和恶性前列腺癌患者的尿液中都能检测到PCA3。通过尿液检测发现,大约95%的前列腺癌患者的PCA3表达都有显著升高。此外,PCAT-1(prostate cancer-associated ncRNAtranscript 1)在转移性前列腺癌中高表达且具有高度的癌组织特异性。PCGEM1(prostate cancer gene expression marker 1)在前列腺癌中表达升高并且能促进细胞增殖和肿瘤群落形成。越来越多的研究表明,lncRNAs在肿瘤发生发展过程中发挥着十分重要的作用。为进一步阐明与前列腺癌有关的lncRNA调控机制,寻找潜在的有效前列腺癌临床诊断标记物和治疗靶点,我们通过lncRNA高通量测序的方法对前列腺癌组织进行了测序分析。结果发现,长链非编码RNA linc00844在前列腺癌组织中的表达水平显著降低。然而,linc00844与前列腺癌发生发展的关系以及其潜在的调控机制仍不清楚。为了阐明linc00844与前列腺癌的关系以及其潜在的生物学功能,我们通过前列腺癌临床标本检测和分子细胞生物学功能实验对linc00844与前列腺癌之间的相关性进行了系统的研究分析。研究目的前列腺癌发病机制以及临床诊断和治疗的研究是肿瘤研究的热点问题。前期我们发现lncRNA linc00844在前列腺癌组织中表达水平显著降低,提示linc00844与前列腺癌有关,但具体相关性和调控机制不明。在本研究的目的在于阐明linc00844与前列腺癌的临床相关性及其生物学功能和表达调控机制,为寻找更为有效的前列腺癌临床诊断、预后分析标记物和治疗靶点,以及前列腺癌药物的开发提供新的理论依据。研究方法1.实时荧光定量PCR分析比较前列腺癌组织和细胞中linc00844 mRNA的表达情况;2.通过TCGA和Taylor前列腺癌患者数据库数据分析以及基因簇富集分析方法分析linc00844表达水平与前列腺癌患者临床病理参数之间的关系;3.分子克隆方法构建linc00844过表达载体,转染前列腺癌细胞,通过transwell实验观察lirnc00844对前列腺癌细胞侵袭和迁移的影响;4.利用TCGA前列腺癌患者数据库进行生存曲线分析,观察linc00844表达水平与前列腺癌患者预后的相关性;5.雄激素刺激体外培养的前列腺癌细胞,实时荧光定量PCR检测雄激素信号通路是否对linc00844转录表达具有调控作用。研究结果1.linc00844在前列腺癌肿瘤组织中表达情况:实时荧光定量PCR结果发现,与正常组织相比,前列腺癌组织中linc00844的表达显著降低。进一步地,利用TCGA和Taylor数据库中的高通量测序结果进行分析比较,发现linc00844在正常前列腺组织中高表达,而随着前列腺癌的发生与远处转移,其表达量显著降低,提示linc00844可能在前列腺癌的发病过程中发挥了重要的抑癌作用。2.linc00844表达水平与前列腺癌患者的临床病理参数之间的关系:以前列腺癌Gleason评分为标准,将前列腺癌临床标本分为两组:Gleason>7和Gleason≤7组。实时荧光定量PCR结果显示,Gleason>7组样本中linc00844的表达水平要明显低于Gleason《7组的样本。此外,通过利用TCGA和Taylor数据库中的高通量测序结果分析比较,同样也显示Gleason评分越高的PCA组织中,linc00844的表达水平也越低,提示linc00844可能发挥了抑癌作用。3.linc00844表达水平与前列腺癌形成发展的临床相关性:通过对3个独立的高通量测序研究产生的6个数据集进行基因簇富集分析(GSEA),发现那些在前列腺癌、前列腺转移癌以及TMPRSS2-ERG阳性前列腺癌中低表达的基因在linc00844高表达组患者的前列腺癌中都富集表达。相反,那些在上述3种癌组织中高表达的基因在linc00844低表达组前列腺癌患者中富集表达。该大数据分析结果与我们之前的临床病理分析结果一致,均提示linc00844在前列腺癌种可能发挥了重要的抑癌作用。4.linc00844对前列腺癌细胞侵袭迁移的影响:在linc00844低表达的前列腺癌细胞系PC3和DU145中高表达linc00844,细胞transwell实验结果显示,linc00844过表达明显降低了 PC3和DU145细胞的的侵袭迁移能力。5.linc00844表达水平与前列腺癌患者预后的相关性分析:利用TCGA前列腺癌患者数据库进行生存曲线分析,发现linc00844高表达的前列腺癌患者的无复发生存率和总生存率均显著高于linc00844低表达的患者,提示linc00844具有作为前列腺癌的预后分子标记物的潜质。6.雄激素信号通路对linc00844表达的调控:通过分析VCaP细胞的雄激素受体染色质免疫共沉淀测序结果,发现经双氢睾酮作用后,雄激素受体与linc00844基因的结合明显增强,而雄激素受体抑制剂比卡鲁胺、JQ1和MDV3100则能抑制雄激素受体与linc00844的结合。进一步地,在体外培养的VCaP细胞中加入双氢睾酮,分别作用4h、12h和24h,实时荧光定量PCR结果发现,双氢睾酮显著增强linc00844的转录表达,而雄激素受体抑制剂MDV3100则能阻断双氢睾酮引起的linc00844表达升高。以上结果提示,linc00844的表达受雄激素受体信号通路的调控。研究结论1.lncRNAlinc00844是潜在的前列腺癌抑制基因,具有抑制前列腺癌细胞侵袭迁移的作用;2.linc00844的表达与前列腺癌患者的预后相关,具有成为前列腺癌预后分子标记物和治疗靶点的潜质。