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背景:心房颤动（auricular fibrillation,AF）是临床上最常见的持续性心律失常,房颤易导致血栓形成和心室率增快,诱发中风和心力衰竭,不仅严重影响患者自身的生活质量,也给整个社会带来巨大的经济负担。目前对于房颤的治疗,不论是外科手术、导管消融还是抗心律失常药物,其效果均不甚理想。因此,开启房颤防治的新思路和寻找新的治疗靶点具有重要意义。心房颤动的发生与维持机制十分复杂,其基本发病机制主要是心房结构重构（Atrial anatomical remodeling,AAR）与心房电重构（Atrial electroical remodeling,AER）。纤维化是心房结构重构的重要特征;缝隙连接蛋白重构是心房肌电重构的基础及重要组成部分,它们也是导致心房肌传导速度（Conduction velocity,CV）减慢和传导各向异性的重要原因。本课题组前期的研究结果表明,血管紧张素（Angiotensin,Ang）-（1-7）作为内源性血管紧张素II（Ang Ⅱ）的拮抗剂不仅具有改善心肌纤维化的作用,还可显著改善心房快速起搏所致的缝隙连接蛋白表达的异常,而其中涉及的信号转导机制尚未完全阐明。c-Src（Cellular Src）是一种非受体型蛋白酪氨酸激酶,直接介导和参与了Ang Ⅱ对缝隙连接蛋白的调节等多种信号转导通路。SHP-1（Src-homology domain 2 containing protein tyrosine phosphatase-1）是一种非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶,以其去磷酸化效应对c-Src具有重要的负性调节作用。因此,我们认为SHP-1和c-Src可能介导了Ang-（1-7）拮抗Ang Ⅱ所致的心房纤维化及缝隙连接蛋白重构。目的:探讨c-Src和SHP-1的动态调节是否介导了Ang-（1-7）拮抗Ang Ⅱ所致的心房肌缝隙连接蛋白（Cx43）异常表达和心房纤维化及其分子机制。方法:实验分为三个部分:第一部分为体外培养HL-1心房肌细胞,首先用不同浓度AngⅡ和Ang-（1-7）干预细胞,western blot检测TGF-β和CTGF的表达以确定最佳干预浓度和时间。细胞分为六个组:对照,AngⅡ,Ang-（1-7）,AngⅡ+SU6656（c-Src抑制剂）,AngⅡ+Ang-（1-7）,AngⅡ+Ang-（1-7）+SSG（SHP-1抑制剂）组。荧光定量PCR和Western blot检测心房纤维化及蛋白激酶信号通路相关的指标:TGF-β、TIMP-1、MMP-2、CTGF、Galectin-3、ERK1/2、AKT、p38MAPK。Cx43的表达情况用Western blot检测,缝隙连接功能用划痕标记染料示踪技术观察。第二部分为动物实验,构建Ang Ⅱ诱导的Sprague Dawley（SD）大鼠心房重构模型,大鼠随机分为以下6组:对照,AngⅡ、Ang-（1-7）、AngⅡ+Ang-（1-7）、AngⅡ+SU6656、AngⅡ+Ang-（1-7）+SSG组,持续干预时间为4周,给药方式采用静脉微量泵入。尾动脉法评价药物干预前后大鼠的动脉收缩压（systolic blood pressure,SBP）。Picrosirius红染色和Masson三色染色法观察心房纤维化情况。荧光定量PCR、western blot法检测纤维化及蛋白激酶信号通路相关的指标:TGF-β、TIMP-1、MMP-2、CTGF、α-SMA、Galectin-3、Collagen I/III、ERK1/2、AKT、p38MAPK。免疫组化和免疫荧光检测Cx43的表达和分布。第三部分,细胞分为六个组:对照,AngⅡ,Ang-（1-7）,AngⅡ+SU6656（c-Src抑制剂）,AngⅡ+Ang-（1-7）,AngⅡ+Ang-（1-7）+SSG（SHP-1抑制剂）组。通过Western blot检测不同处理组中p-c-Src、c-Src、p-SHP-1、SHP-1的表达情况。在HL-1细胞中过表达SHP-1,通过实时荧光定量PCR、Western blot和免疫荧光法检测SHP-1、p-c-Src和Cx43的表达。Co-IP检测SHP-1与c-Src在细胞中的定位及相互作用。DNA pull down、染色质免疫共沉淀（Ch IP）和双荧光素酶报告系统检测c-Src和Cx43的相互作用。结果:细胞部分结果显示:Ang Ⅱ的最佳干预浓度是10-5 mol/L,最佳干预时间是24 h;Ang-（1-7）的最佳干预浓度是10-6 mol/L。与对照组相比,AngⅡ处理的HL-1细胞中,TGF-β、TIMP-1、MMP-2、CTGF、Galectin-3、p-ERK1/2、p-Akt、p-p38MAPK的表达水平显著升高;与AngⅡ组相比,添加Ang-（1-7）或c-Src特异性抑制剂（SU6656）组中,上述基因和蛋白的表达出现逆转。AngⅡ+Ang-（1-7）中添加SHP-1特异性抑制剂（SSG）后,可以逆转Ang-（1-7）对AngⅡ的拮抗作用。Cx43的表达也随着AngⅡ浓度的升高而降低,Ang-（1-7）处理后部分恢复Cx43的表达。此外,AngⅡ干预HL-1细胞可抑制Cx43的表达和增加缝隙连接蛋白传导距离,而Ang-（1-7）处理和抑制c-Src能够逆转AngⅡ的这一效应,但单独Ang-（1-7）处理并不会明显影响Cx43的表达和缩短其传导距离。加入SHP-1抑制剂后,Ang-（1-7）不能抵消Ang Ⅱ所致的Cx43表达异常。动物部分结果显示:Ang Ⅱ干预使大鼠血压升高,导致心房纤维化。Ang-（1-7）可逆转Ang Ⅱ诱导的大鼠心房纤维化,但不能降低Ang Ⅱ诱导的血压升高。与细胞部分结果一致,Ang Ⅱ干预组TGF-β、TIMP-1、MMP-2、CTGF、α-SMA、Galectin-3、Collagen I表达显著升高,p-ERK1/2、p-Akt、p-p38MAPK表达也显著升高。Ang-（1-7）、AngⅡ+Ang-（1-7）和AngⅡ+SU6656组中,上述基因和蛋白的表达显著降低。AngⅡ+Ang-（1-7）+SSG组中,Ang-（1-7）对AngⅡ的拮抗作用被逆转。Cx43的表达情况也与细胞中一致,AngⅡ处理降低Cx43的表达水平,Ang-（1-7）处理和抑制c-Src能够逆转AngⅡ的负作用,抑制SHP-1后Ang-（1-7）不能抵消Ang Ⅱ所致的Cx43表达异常,但单独Ang-（1-7）处理并不会显著影响Cx43的表达。第三部分结果显示:Ang Ⅱ可以促进c-Src的磷酸化,同时弱化SHP-1的磷酸化。Ang-（1-7）通过促进SHP-1的磷酸化,拮抗Ang Ⅱ诱导的c-Src激活。过表达SHP-1可抑制c-Src的磷酸化和激活,增加Cx43的表达。SHP-1与c-Src之间存在直接结合;c-Src可以结合Cx43的启动子,从而抑制Cx43的转录。结论:本研究主要发现:（1）AngⅡ上调心房纤维化相关的调节因子TGF-β/MMP-2/TIMP-1/CTGF/Galectin-3和Collagen I的表达以及,激活p38MAPK、ERK1/2、AKT等蛋白激酶的活性,从而促进心房纤维化;（2）Ang-（1-7）通过降低上述促纤维化相关信号分子的表达拮抗AngⅡ诱导的负作用,从而表现出抗纤维化的效果;（3）AngⅡ导致Cx43的异常表达和增加其细胞间传导距离;（4）Ang-（1-7）促进SHP-1的磷酸化,活化的SHP-1抑制Ang Ⅱ诱导的c-Src激活,从而增加Cx43的表达,改善心肌缝隙连接蛋白重构;（5）SHP-1可以促进Cx43的表达以及降低磷酸化c-Src蛋白的表达,提示SHP-1可以改善心肌缝隙连接蛋白Cx43异常表达。综上所述,c-Src与SHP-1的动态调节可能是Ang-（1-7）拮抗AngⅡ保护性信号通路的中心环节。Ang-（1-7）通过调节SHP-1和c-Src,激活蛋白激酶信号通路相关蛋白（ERK1/2、Akt、p38MAPK）的活性,下调促心房纤维化相关的调节因子TGF-β/MMP-2/TIMP-1/CTGF/Galectin-3的表达,从而减少Collagen I的积累和增加Cx43的表达,来拮抗AngⅡ诱导的心房纤维化和心肌缝隙连接蛋白重构,最终发挥保护作用。