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离子液体(ionicliquids,ILs)具有低的蒸汽压、良好的溶解能力及可调的结构等独特性质,在酶催化领域可以用作反应介质,表现出优于传统有机溶剂的特性。但直接将离子液体用作反应介质,对有些酶而言存在着酶活性低甚至完全失活、ILs黏度高、用量大及不易回收等缺点。负载化离子液体(supportedionicliquids,SILs)是通过物理或化学过程将离子液体负载到固体介质表面或内部,能够增强酶的活性或稳定性、降低离子液体用量及黏度、实现离子液体回收利用。本论文从离子液体种类的选择、负载量调控、浓度及固定化方式优化等方面入手,开展了离子液体在青霉素G酰化酶(penicillinGacylase,PGA)固定化中应用的研究。
制备了超顺磁性SiO2纳米颗粒负载化离子液体(Fe3O4/SiO2-ILs-X,X=Cl-,BF4-,PF6-和Tf2N-),比饱和磁强度27.47emu/(gSiO2),平均粒径210nm。离子液体以共价键形式负载到载体表面。综合考虑酶固定化效果的多种指标,如酶负载量、比活、固定效率及酶的稳定性,亲水性负载化离子液体在固定PGA时优于疏水性离子液体。PGA在负载化离子液体表面的吸附过程符合Pseudo-second-order动力学模型;负载化离子液体对PGA的吸附速率要快于没有经过离子液体修饰的载体(如裸露的Fe3O4/SiO2)。游离PGA最适pH值为9左右,而固定化PGA最适pH值为7左右。固定化PGA对温度的响应性与离子液体种类有关。负载化离子液体固定化PGA在循环使用9次之后保留70%的初始活性,比没有经过离子液体修饰的载体循环使用性能(40%)提高了1.8倍。
通过载体粒径调节法和条件控制法,对负载化离子液体制备过程中如何调控离子液体负载量进行了研究。结果表明控制载体粒径能够调控离子液体负载量,但该法仅适用于粒径具有可调性的载体。在制备负载化离子液体过程中,溶剂法和溶胶凝胶法都能够成功调控离子液体负载量。在溶剂法中,三乙氧基硅烷功能化离子液体在SiO2表面的负载量在不同介质中有以下顺序:乙醇<乙醇/水<THF/水<丙酮<水<[BMIM]Cl/水<THF<甲苯,其中混合溶剂的体积比为1∶1。在溶胶凝胶法中,通过控制反应时间0~48h,能够将离子液体负载量在0~0.17mmol/(gSiO2)范围内调控。溶胶-凝胶法比溶剂法有更高的离子液体负载量和更宽的调控范围。载体的zeta电位和等电点均随着离子液体负载量的升高而增大。随着离子液体负载量的升高,PGA的固定量逐渐下降,但固定化PGA的表观活性和比活均升高;固定化PGA的循环使用性同时受到离子液体负载量和载体形貌的影响。
为了进一步提高PGA固定化后的活性和固定化效率,开发出离子液体在酶催化过程中新的使用形式,即海藻酸钙空心微囊包埋离子液体-PGA复合物。实验首先对PGA相容性的离子液体进行筛选,结果表明阳离子上带有长的烷基链(如C10)、乙酸根或者阴离子为FeCl4-的离子液体对PGA活性有强的破坏作用。[BMIM]Br在不同浓度下能够将PGA活性提高约1.1~1.3倍。用[BMIM]Br对PGA进行修饰,形成[BMIM]Br-PGA复合物,然后利用海藻酸钙空心微囊对[BMIM]Br-PGA复合物进行包埋固定化。结果表明无论是在游离形式下还是在包埋固定化下PGA的活性都得到提高。微囊直径约2~3mm,壁厚约0.1~0.3mm。PGA的包埋率近100%,克服了吸附法固定化中PGA固定率低和比活下降的问题。与负载化离子液体吸附法固定PGA相比,海藻酸钙空心微囊包埋离子液体-PGA复合物操作过程更为简单,PGA固定后活性和固定化效率更高,因此更有应用前景。
通过对[BMIM]Br-PGA体系进行紫外光谱、荧光光谱、zeta电位和蛋白质胶团大小等表征和分析,探索了离子液体对PGA活性影响的内在机制。随着[BMIM]Br-PGA体系中[BMIM]Br浓度的升高,PGA分子中芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和/或色氨酸)的紫外吸收强度逐渐下降且发生位移,而它们的荧光强度则在PGA完全失去活性时达到最大。PGA表面电位总体变化趋势是随着[BMIM]Br的升高而降低。随着体系中[BMIM]Br浓度的升高,PGA溶液中蛋白质胶团粒径逐渐增大。由此推测,离子液体通过分子和胶团两个层次来影响PGA活性:在分子层次上,与PGA表面芳香族氨基酸残基相互作用,改变PGA构象和表面性质;在胶团层次上,高浓度离子液体引发PGA溶液中蛋白质团聚,使得胶团粒径增大,进而影响其催化性能。本论文为离子液体进一步的工业应用提供了基础数据。