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目的:
构建一种新型的RGD肽介导的聚乙二醇(PEG)化脂质核胶束递药系统,用于包载高脂溶性化疗药物多烯紫杉醇(Docetaxel,DTX),提高其对肿瘤部位的靶向性和抗肿瘤效果。
方法:
1、建立递药系统中DTX的体内外含量测定方法,并进行方法学验证。
2、载DTX的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)脂质核胶束(DTX-M)的构建优化:以载药量、粒径为指标,对DTX-M的处方和制备工艺进行筛选,确定最佳处方工艺。对由最佳处方工艺所制DTX-M的形态、粒径、载药量及体外释放行为进行表征。
3、RGD肽修饰的DTX-M(RGD-DTX-M)的构建优化:以包封率、载药量、粒径、Zeta电位为指标,对RGD-DTX-M的处方和制备工艺进行筛选。考察其体外释放行为,并采用人乳腺癌细胞株MDA-MB-231评价RGD-DTX-M表面连接RGD的数量、马来酰亚胺修饰的PEG-DSPE(MAL-PEG-DSPE)的比例对其抑瘤效果的影响,进一步优化处方工艺。
4、采用人乳腺癌细胞株MDA-MB-231对RGD-DTX-M进行体外肿瘤靶向性评价和内吞机理探讨。
5、将RGD-DTX-M与市售DTX注射液(艾素)比较,进行体内药代动力学研究,以及对小鼠S-180肉瘤的药效学初步研究。
6、以CCK-8实验评价胶束材料对MDA-MB-231细胞的毒性,并采用HE染色法评价RGD-DTX-M在小鼠静脉给药后的体内毒性。
结果:
1、所建立的体内外含量测定方法灵敏度高、专属性强,DTX与杂质能有效分离,线性、精密度、回收率、检测限、定量限均能满足分析要求。
2、采用薄膜水化法制备DTX-M,确定最佳处方工艺为:PEG-DSPE∶ DTX=15∶1,成膜时间30min,冻干时间24 h,水化时HBS加入量为2 mL。由此制得的DTX-M具有良好的形态、粒径及载药量,且在血浆中具有一定的缓释效应。
3、采用薄膜水化法制备RGD-DTX-M,确定最佳处方工艺为:按质量比40∶1称取PEG-DSPE和MAL-PEG-DSPE溶于氯仿,按辅料∶主药=40∶1称取DTX溶于甲醇,两者混匀后于38℃旋蒸30 min,冻干24 h以上,用一定量pH7.4的HBS水化、稀释,用0.22μm滤膜过滤得到DTX-M。称取RGD用HBS配制成溶液,在磁力搅拌下,按MAL-PEG-DSPE的2倍摩尔过量滴加入DTX-M,继续搅拌12h即得。由此制得的RGD-DTX-M与DTX-M相比,同样具有良好的理化性质、血浆相容性以及缓释作用。
4、体外细胞试验结果证实RGD-DTX-M具有良好的体外靶向性,其被细胞摄取时,可能经由细胞质膜微囊穴样凹陷介导,整个过程需要消耗ATP,并且有高尔基体的参与,也需要通过酸性溶酶体。
5、药代动力学研究结果表明RGD-DTX-M的AUC是市售DTX注射液的3.2倍,CL是市售DTX注射液的0.3倍,表明本递药系统与注射液相比,在血液中的滞留时间明显增加,血浆清除率显著降低,有一定的缓释效果。其对S-180肉瘤的抗肿瘤作用高于市售DTX注射液,抑制率为59.40%,是市售DTX注射液的1.4倍。
6、胶束材料对MDA-MB-231细胞无明显毒性,RGD-DTX-M静脉给药后对小鼠各组织未引起器质性损伤,初步证实RGD-DTX-M具有较好的安全性。
结论:
本课题构建的RGD-DTX-M新型递药系统能够显著提高DTX的靶向性和抗肿瘤效果,为乳腺癌提供了一种有效的治疗手段,具有较高的临床应用前景和良好的社会效益。