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拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海城市具有较高经济价值的养殖品种。但随着养殖规模和养殖密度的增加,病害问题日益严重,成为阻碍产业发展的一个重要瓶颈,而水中溶解氧的缺乏是造成疾病发生的重要原因之一。病毒是导致拟穴青蟹发病的一类重要病原,而其在宿主体内的繁殖需要宿主提供能量和物质,为了解低氧环境下病毒病容易爆发的机制,本文研究了低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)对拟穴青蟹糖代谢途径中乳酸脱氢酶(SpLDH)、磷酸果糖激酶(SpPFK)和果糖-1,6-二磷酸激酶(SpFBP)的调控作用以及对青蟹体内病毒繁殖的影响;另外,还克隆了拟穴青蟹c-型溶菌酶(SplyzC)全长,研究了其组织分布和生物学功能。具体研究成果如下:(1)克隆了拟穴青蟹SpLDH、SpPFK和SpFBP cDNA基因全长,序列分析结果显示:SpLDH cDNA序列全长1453 bp,开放阅读框包含996 bp核苷酸,编码332个氨基酸,蛋白理论分子量36 kDa,理论等电点为7.63,序列比对发现与夏威夷红虾(Halocaridina rubra)LDH相似性最高,为89%;SpPFK基因cDNA序列全长为3634 bp,开放阅读框包含2859 bp核苷酸,编码953个氨基酸,蛋白理论分子量105.66 kDa,理论等电点5.76,序列比对发现与克氏螯虾(Procambarus clarkii)PFK相似性最高,为83%;SpFBP基因cDNA序列全长1445bp,开放阅读框包含1005 bp核苷酸,编码335个氨基酸,蛋白理论分子量36.17kDa,理论等电点6.45,序列比对分析发现与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)FBP相似性最高,为92%。实时荧光定量PCR分析发现SpLDH、SpPFK和SpFBP在拟穴青蟹各个组织中均有表达,其中:SpLDH在血细胞中表达量最高,鳃和心脏次之,黏膜中表达量最低;SpPFK在鳃中表达量最高,血细胞和肌肉中次之,黏膜中最少;SpFBP在肝胰腺中表达量最高,心脏和胃中次之,肌肉中最少。注射dsRNA-HIF-1α(简称dsHIF-1α)后被检测组织中的SpLDH、SpPFK和SpFBP表达均显著下调。在低氧状态下:SpLDH表达量在鳃中最高,其次是心脏和血细胞,肠和黏膜中最低;SpPFK在鳃和心脏中表达量较高,血细胞肌肉和胃中次之;SpFBP在肝胰腺、心脏和黏膜中表达量较高,鳃、胃和肠中次之。常氧和低氧状态下,SpLDH和SpPFK在检测组织中表达量均上调,SpFBP除了在血细胞中表达量下调外在其余检测组织中也都表现为上调。干扰HIF-1α的表达后,在低氧环境下SpLDH、SpPFK和SpFBP表达以及LDH活性和乳酸堆积量同有氧环境相比没有发生显著变化。感染青蟹双顺反子病毒(Mud Crab Dicistrovirus-1,MCDV-1)后,SpLDH、SpPFK和SpFBP表达都不同程度上调。干扰HIF-1α的表达后,人工感染MCDV-1,拟穴青蟹SpLDH、SpPFK和SpFBP表达量和LDH活性相对于直接人工感染病毒变化降低,葡萄糖和乳酸含量也会降低且病毒拷贝数和死亡率都会大幅度下降。(2)拟穴青蟹SplyzC基因全长849 bp,开放阅读框包含669 bp核苷酸,编码223个氨基酸的蛋白,蛋白理论分子量为23.7 kDa,理论等电点为8.90。序列比对结果显示SpLyzC与来自其他甲壳动物的c-型溶菌酶相似性仅为23%-68%,但溶菌酶活性位点高度保守;SplyzC可以在所有检测组织中检测到,在肝胰腺组织中表达水平最高。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和MCDV-1感染都可导致拟穴青蟹肝胰腺和鳃组织中SplyzC表达上调。重组蛋白rSpLyzC在体外对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黄色葡萄球菌、哈维弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血弧菌均具有抗菌活性。注射SpLyzC的双链RNA干扰SpLyzC表达后人工感染副溶血性弧菌,拟穴青蟹血淋巴中细菌的浓度和拟穴青蟹的死亡率均升高;干扰SpLyzC表达后感染MCDV-1,拟穴青蟹被检测组织中病毒拷贝数和死亡率均升高。综上所述,低氧胁迫和MCDV-1感染可引起SpLDH、SpPFK和SpFBP的表达上调,HIF-1可以调控SpLDH、SpPFK和SpFBP的表达及MCDV-1在拟穴青蟹体内的繁殖,从而降低该病毒感染导致的死亡;SpLyzC可在拟穴青蟹多个组织中表达,具有广谱的抗菌活性,对病毒的侵染也有一定的抵抗作用。