近年来,肥胖及其密切相关的代谢性疾病,包括非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)、代谢综合征(Metabolic syndrome, MS)和2型糖尿病等患病率日益攀升,严重危害全球人类的健康。NAFLD目前被认为是全球最普遍的慢性肝脏疾病,其在肥胖和糖尿病人群中的患病率显著高于健康人群。此外,这些疾病会进一步导致动脉粥样硬化、冠心病(Coronary heart disease, CHD)等心血管疾病的发生发展。NAFLD最显著的病理改变为肝脏脂质尤其是甘油三酯(Triglyceride, TG)异常聚集在肝脏细胞造成脂毒性损伤肝细胞,影响肝功能。虽然目前脂质沉积的具体机制存有争议,但脂质生成(脂肪酸从头合成)、脂质的转运和脂肪酸氧化等相关代谢途径出现代谢紊乱必然造成肝脏脂质沉积。目前,针对NAFLD的临床相关药物如噻唑烷二酮类药物和生活方式改善等在疗效和安全性上不尽如人意；因此,利用我们的优势聚焦到开发中医药改善血脂紊乱及保护肝脏脂肪变就显得十分必要。课题组李平教授在继承前人经验和以多年临床经验提出治疗糖尿病肾病的重要组方糖肾方,并创新性提出了从肝论治糖尿病肾病理念；前期多中心临床研究表明其可有效降低24 h尿蛋白和提高肾小球滤过率；但其对于糖尿病伴随的脂代谢紊乱是否具有改善作用以及具体的分子机制是什么?基于上述背景知识,本研究主要利用NAFLD模型C57BLKS/J db/db小鼠,第一部分从整体动物实验水平观察糖肾方是否具有改善脂代谢紊乱和保护肝脂变的作用；在此基础上,第二部分围绕脂质沉积开展糖肾方作用的具体机制研究：1)AMPK/SREBPs介导的脂质生成途径；2)AMPK/Sirt1/PGC1α介导的脂肪酸p氧化代谢途径；3)PI3K/Akt/mTOR信号通路及糖异生途径；4)肝脏和白色脂肪组织巨噬细胞活化分型探索中药糖肾方颗粒对db/db小鼠脂质代谢紊乱的调节尤其是肝脏脂肪变的潜在保护作用及相关机制。目的：利用db/db小鼠观察中药糖肾方颗粒对糖尿病伴随的脂代谢紊乱调节和保护肝脏脂肪变的作用,并围绕脂质沉积这一病理改变深入探讨相关机制。方法：8周龄雄性db/db和db/m小鼠随机分成3组(n=9),正常对照组(db/m)、模型组(db/db)、糖肾方组(db/db+TSF,2.4 g/kg/day),所有小鼠均以常规普通饲料喂养。顺应性喂养2周后观察基础状态并称重,开始给予糖肾方干预,每周测量小鼠体重。糖肾方给药干预12周后,禁食12 h后眼内眦取血,全自动生化仪检测血脂、血糖、血清游离脂肪等项目；处死小鼠,迅速分离小鼠肝脏、骨骼肌及白色脂肪等,用冷磷酸盐缓冲液洗净,滤纸吸干水分,称重记录,计算肝重指数；一部分肝组织放入细胞冻存管中存入液氮备用,另一部分直接存入-80℃用于后续冰冻切片；其余放入中性福尔马林溶液固定用于病理分析。骨骼肌及白色脂肪组织立即存入液氮中备用。利用高效液相色谱方法建立的化学成分指纹谱图全面评价中药糖肾方颗粒的质量；H&E染色及油红O染色观察小鼠肝脏脂肪变及糖肾方干预情况；利用Western blot、Real-time PCR、IHC、免疫荧光及Confocal技术检测糖肾方对各组小鼠肝组织中脂质生成途径中pAMPK/SREBPs及下游靶基因表达的影响；利用以上方法检测糖肾方对各组小鼠肝组织和骨骼肌中脂肪酸p氧化途径中相关代谢酶的表达影响；利用以上方法检测糖肾方对各组小鼠肝组织PI3K/Akt/mTOR信号通路及糖原合成的影响；利用Real-time-PCR、IHC检测糖肾方对各组小鼠肝脏和白色脂肪组织巨噬细胞的影响。结果：1.糖肾方对db/db小鼠脂代谢调节及肝脂变保护作用：干预6周后,糖肾方可以显著减轻db/db小鼠体重；干预12周即实验终点时,其可显著减轻db/db小鼠体重、肝重及肝重指数；肝脏形态学表明db/m小鼠肝脏形态正常,色泽红润,质地柔软。db/db小鼠肝组织体积增大,有明显肿胀感,色泽土黄,质地较硬,表面油腻感较显著,提示该组小鼠肝脏脂肪变严重,而糖肾方干预可明显改善以上病变；糖肾方可以显著降低小鼠血清中ALT、AST、TG、TC、LDL-C、LDL-C/HDL-C、FFA等因子水平,改善血脂水平和肝功能,但对血糖水平无显著改善；H&E和油红O染色结果显示糖肾方可显著减少db/db小鼠肝组织脂滴和空泡数量、改善肝组织结构、减少炎性细胞浸润,油红O阳性着色面积减少。2.糖肾方改善db/db小鼠肝脏脂肪变的可能作用机制：2.1糖肾方对db/db小鼠肝组织AMPK/SREBPs及其下游脂肪酸从头合成靶分子的影响：Western Blot和Confocal结果显示糖肾方可显著上调pAMPK水平及抑制转录因子SREBP1的表达及入核；糖肾方可显著下调FAS、SCD1、HMGCR及HMGCS等脂质从头合成途径(De novo lipogenesis, DNL)和胆固醇合成关键代谢酶的表达,显著上调pACC蛋白水平和AdipoR1/2基因表达水平；2.2糖肾方对db/db小鼠肝脏与骨骼肌脂质氧化途径的影响：糖肾方可显著增加db/db小鼠肝脏脂质氧化关键分子Sirt1、PGC1、PPARα、MLYCD和CPT1A等基因及蛋白表达；糖肾方可以显著上调脂质氧化相关基因Acox1、Acadm等表达,同时减少LXRα和LOX1的表达；免疫荧光实验进一步显示了糖肾方可以降低db/db小鼠肝组织FAS、CPT1A和MLYCD的表达；糖肾方同时可显著增加db/db小鼠骨骼肌pAMPK、Sirt1、PGC1α和MLYCD的蛋白表达水平；与此同时上调CPT1B、 Acadm基因表达和下调Ucp2/3基因表达；糖肾方可降低db/db小鼠肝组织TG水解和FFA转运相关基因LPL和FAT/CD36的表达水平,降低肝组织FFA和TG浓度；此外,糖肾方可显著增加db/db小鼠骨骼肌中线粒体生物合成基因Tfam和Esrra的表达水平；2.3糖肾方对db/db小鼠肝组织PI3K/Akt/mTOR信号通路及巨噬细胞活化的影响：糖肾方可显著增加db/db小鼠肝组织PI3K/Akt蛋白水平和减少pmTOR水平,提示可以改善肝组织胰岛素抵抗与mTOR介导的脂质沉积；与此同时糖肾方可显著增加db/db小鼠肝组织糖原合成水平并下调糖异生途径中Pck1、G6pc基因表达及上调GK基因表达；糖肾方可显著下调db/db小鼠肝脏和白色脂肪组织巨噬细胞活化标记物CD68和F4/80基因表达水平；进一步发现糖肾方可显著下调白色脂肪组织M1标记物TNFα及Cc12、Ucp2基因水平,但对M2标记物Mrc1和Argl无显著作用。结论：糖肾方可降低db/db小鼠体重及肝脏系数,降低血脂水平,显著改善db/db小鼠的脂质代谢紊乱和肝脏脂肪变；其机制可能与糖肾方通过调控AMPK/SREBPs及其下游靶基因表达抑制db/db小鼠肝组织脂质生成、通过Sirt/PGC1α增加肝组织与骨骼肌脂肪酸氧化利用,同时调节PI3K/Akt/mTOR信号通路及巨噬细胞活化等代谢途径相关。由此提示我们糖肾方改善db/db小鼠肝脂变可能是通过发挥多脏器联合效应,调控机体代谢稳态而实现的。