论文部分内容阅读
目的骨缺损是临床上常见的一种疾病,主要由于先天性疾病、创伤及术后感染等导致。关于骨缺损的治疗方法主要有骨组织工程、自体骨移植、同种异体骨移植等。由于自体骨移植和同种异体骨移植存在难愈合,易产生排斥反应等风险,骨组织工程作为一种新兴技术,正在应用于骨缺损的治疗。BMP9作为强有力的成骨诱导因子,可促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞,在骨缺损治疗中发挥着关键作用。前期我们通过miRNA芯片筛选BMP9诱导间充质干细胞成骨过程中相关miRNA,发现包括miR-17在内的miR-17-92基因簇多个成员均表达下调。通过体内、体外成骨实验证明miR-17能有效的抑制BMP9诱导的MSCs成骨分化。本文主要探讨miR-17-92基因簇中的成员miR-17-5p(后续称为miR-17)在BMP9诱导间充质干细胞iMEF成骨中的作用,希望通过我们的研究,为骨缺损的临床诊断提供一定的分子生物学基础。方法以Piggybac系统为基础构建质粒,命名为pMPB-OMIR,作为对照组。实验组为miR17-OMIR和Sponge17-OMIR;将携带有目的基因的重组质粒和空载质粒稳定转染iMEF细胞系后,绿色荧光蛋白高效表达,提示稳转细胞系构建成功;运用生物信息学方法对miR-17进行靶蛋白基因预测,共筛选出三个潜在下游靶基因,通过双荧光素酶报告基因实验确定目的靶基因;为了进一步验证miR-17基因对下游靶基因的调控作用,构建下游靶基因RB1的突变体,再次进行双荧光素酶实验;通过细胞学实验ALP染色验证早期成骨情况,茜素红染色验证晚期钙结节形成情况;通过裸鼠皮下注射,使裸鼠体内形成骨包块,对骨组织包块进行Masson三色染色和HE染色,观察检测包块内成骨细胞的数量和骨质成熟度。结果(1)通过体内、体外成骨实验证实miR-17能抑制BMP9诱导的MSCs成骨分化,Sponge-17能部分恢复其抑制作用。(2)测序验证重组质粒RB1 3’UTR-pMIR、BMPR2 3’UTR-pMIR、SMAD7 3’UTR-pMIR构建成功。(3)双荧光素酶报告基因实验显示RB1为miR-17的直接下游靶基因,而BMPR2、SMAD7非miR-17的直接下游靶基因。RB1-3’UTR(1.137±0.1073)的细胞相对荧光素酶活性较对照组pMPB-OMIR(1.517±0.01314)明显降低(P<0.001)。(4)通过体内、体外成骨实验进一步证明RB1可以部分逆转miR-17在BMP9诱导MSCs中的成骨作用。结论miR-17基因在BMP9诱导间充质干细胞成骨中,具有一定的抑制作用,这种抑制作用可能是通过其下游直接靶基因RB1来实现。研究意义已通过体内、外实验初步表明miR-17抑制BMP9诱导间充质干细胞成骨,试图通过靶向调节miR-17,增强BMP9诱导间充质干细胞成骨的作用。期望通过本课题的研究,为研发更高效的生长因子提供扎实的实验基础。