本论文主要在5L罐上对基因工程菌毕赤酵母(pichiapastoris)表达瑞普替酶(rPA)的发酵条件进行了研究。 通过对基因工程菌毕赤酵母表达rPA发酵过程的研究，发现rPA是一个很不稳定的蛋白质，表达效率受发酵条件的影响很大。其中诱导相温度是影响细胞比生长速率最重要的因素，通过将诱导温度从30℃降低到25℃，能大大提高菌体消耗甲醇的速率，使得诱导相细胞的平均比生长速率从0.01h-1增加到0.021h-1，从而使rPA蛋白的最大表达量从10mg/L提高到约40mg/L左右；通过对pH的研究，发现pH是影响rPA蛋白表达的重要因素，在低的pH条件，rPA蛋白的表达量很低，rPA蛋白表达的最适pH为6.5，在此条件下，rPA蛋白的表达量可以稳定达到40mg/L左右。 通过对不同的诱导前菌体密度进行比较，发现在OD600为70左右开始诱导能使甘油相和诱导相获得更高的细胞活性和平均比生长速率，rPA蛋白能在更短的时间即诱导后48hr左右达到最大值40mg/L左右，比从其它菌体密度开始诱导时达到相似的表达量水平周期更短，最多可提前24小时左右。 比较了两种常用的补料策略：基于溶氧(DO)控制甲醇流加速率和基于甲醇电极在线测定残留甲醇浓度控制甲醇流加速率，发现两种控制方式能够得到相似的菌体密度和蛋白表达量，而基于溶氧(DO)控制甲醇流加速率的补料策略能节约甲醇消耗，产物得率约为0.079mg/gmethanol，比前者的产物得率提高了27％，这很可能和rPA蛋白较低的表达水平有关。因此确定选用基于溶氧控制甲醇流加速率的策略。 同时，采用流式细胞仪对发酵过程中的细胞活性进行测定，发现细胞活性随发酵条件的改变而发生变化，降低诱导相培养温度能使细胞死亡率减少一半，而改变诱导相pH对细胞死亡率没有太大的影响，从高菌体密度开始进行诱导将增加甘油相和诱导相的细胞死亡率，采用经过优化后的发酵条件能在诱导相保持较高的细胞活性。 通过对发酵上清液进行蛋白电泳(SDS-PAGE)分析和Western-blotting检测，发现在发酵上清液中主要在66KD和43KD位置存在两条杂带，确认只有39KD位置的蛋白条带为目的蛋白—rPA蛋白。