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J亚群禽白血病毒(Avian leucosis virus subgroup J,ALV-J)属于反转录病毒科禽C型反转录病毒属,其感染后能够在易感宿主体内引发禽白血病,造成髓细胞瘤、血管瘤、平滑肌瘤等症状。该病与禽马立克氏病、禽网状内皮增生病一样,既属于禽致肿瘤性疾病也属于禽免疫抑制性疾病,给养禽业带来巨大经济损失。对ALV-J致病机制的研究是防制该病的重要部分。病毒是如何入侵宿主细胞?如何突破宿主的天然免疫屏障?相关研究报道较少。本研究将围绕病毒的进入和与宿主的相互作用开展研究,旨在深入研究禽类免疫抑制机理,寻找潜在药物靶点,进一步丰富禽类反转录病毒研究的分子生物学信息资料,为后续的研究工作奠定基础。1、膜蛋白GRP78参与ALV-J入侵宿主细胞本实验室于2015年成功发现一个ALV-J的新型受体chANXA2,于此同时,也发现了另一个能够与ALV-J囊膜蛋白结合的宿主蛋白chGRP78。GRP78蛋白作为热休克蛋白家族成员被人们所熟知,且已经被报道在多种病毒复制中起到了关键作用。前期试验数据显示,用针对chGRP78的多克隆抗体封闭DF1细胞膜表面的chGRP78能够有效抑制ALV-J的复制。为进一步探究chGRP78功能,本研究应用siRNA干扰技术,通过对DF1细胞转染针对chGRP78蛋白的siRNA,成功将DF1细胞中chGRP78的基因表达水平抑制了 65%。在此基础上,进行ALV-J感染,TCID50和Western-blot结果显示,在降低宿主细胞chGRP78蛋白的表达后,ALV-J的感染显著抑制。进一步研究发现,在ALV-J非易感细胞293T中转染不同浓度chGRP78真核表达质粒(0.5μg、1.5μg、3.0μg和4.5μg),结果显示,随着转染chGRP78浓度的不断增高,ALV-J入侵293T细胞的能力逐渐增强,成明显的正相关。为进一步证明该结果的正确性,本研究选择另一 ALV-J非易感的禽类细胞——鹅胚成纤维细胞(Goose embryo fibroblast,GEF),结果显示,在GEF中转染chGRP78后,能够成功将非易感细胞转变为易感细胞。综上所述,chGRP78蛋白在ALV-J感染DF1细胞中发挥了重要的作用,该蛋白能够帮助ALV-J进入宿主细胞。2、Toll样受体在ALV-J感染中的作用除chGRP78外,本研究特别对先天性免疫相关受体在ALV-J感染过程中发挥的作用进行了探究。在ALV-J感染CEF细胞前16h、感染同时、感染后第12h、24h、48h和72h分别用6种禽类Toll样受体(TLR2-5、TLR7和TLR21)对应的配体刺激宿主细胞。同时用Real-time PCR、IFA、Westem-blot和上清中ALV-J病毒滴度进行检测,以了解CEF细胞中ALV-J复制情况。结果显示TLR2、TLR3和TLR4相对应配体不管在ALV-J感染前还是感染后对CEF进行刺激,均能够抑制ALV-J在CEF中的复制;TLR7和TLR21配体在ALV-J感染前及感染后24h内刺激能抑制ALV-J的复制;而TLR5配体在ALV-J感染前刺激并未影响ALV-J的复制,但在ALV-J感染同时加入TLR5配体对ALV-J复制有一定影响。综上所述,CEF细胞的Toll样受体被激活后,均能抑制ALV-J病毒的复制,只是刺激时间不同有所差别。这提示,从宿主细胞的角度来看,天然免疫的激活能够抑制ALV-J的感染。而从病毒的角度来看,其在细胞中成功建立感染的过程,很可能抑制了上述某些受体信号通路。3、ALV-J感染宿主细胞CEF激活了非MyD88依赖途径为弄清ALV-J通过抑制哪条TLR介导的先天免疫通路以建立感染。本研究首先用PEG-it试剂浓缩ALV-J病毒(以排除收集的病毒上清中存在某些细胞因子对试验产生影响),ALV-J 感染宿主细胞 CEF 后,通过 Real-time PCR 方法检测TLR2、TLR TLR4、TLR7和TLR21在ALV-J感染后不同时间点被激活的情况。结果显示,ALV-J在感染宿主细胞CEF时,于感染后第72h和96h激活TLR3通路(MyD88非依赖途径),而其余Toll样受体(均为MyD88依赖途径)的基因水平表达并未出现明显变化。为进一步检验ALV-J感染CEF激活非MyD88途径这一现象,本研究用Real-timePCR方法检测MDA5(RIG-I通路,MyD88非依赖途径)的表达情况,结果观察到ALV-J感染CEF同样能激活MDA5的上调。这一结果证明,ALV-J在感染宿主细胞CEF时主要激活MyD88非依赖途径。同时Real-time PCR试验结果显示,ALV-J在感染CEF过程中能够激活TLR3通路,同时也能够引起IRF3/7的上调。IRF3/7作为转录因子处于TLR3通路的下游,说明ALV-J并未对该通路的中间环节造成抑制,然而我们发现ALV-J感染细胞后即使1IRF3/7基因高水平表达,但并不引起TLR3信号通路下游IFN-β 和IFN-α上调,也并未抑制ALV-J的复制。提示虽然宿主细胞天然免疫机制能够识别ALV-J,但ALV-J的复制很可能通过破坏或阻碍信号通路中的某个环节(如IRF3/7功能的干扰)而发挥抗天然免疫功能。4、鸡IRF3/7在抗ALV-J天然免疫中的作用IRF3/7是介导细胞表达I型干扰素最关键的转录因子,其转录活性与生物学功能直接影响细胞的抗病毒的能力,而目前市面上并无鸡IRF3/7抗体的销售,给禽类天然免疫学的研究带来巨大瓶颈,故本研究成功构建原核表达质粒pCold-TF-chIRF3/7,将原核表达蛋白作为免疫原免疫5周龄Balb/c雄性小鼠,每隔10天免疫一次,共免疫4次,通过IFA和Westem-blot鉴定,成功制备了鸡IRF3/7的多克隆抗体,为禽类天然免疫研究突破瓶颈,奠定基础。同时,本研究成功构建pcDNA3.1-chIRF3/7真核表达质粒,ALV-J感染已过表达chIRF3/7的DF1细胞,用Real-time PCR检测ALV-J基因水平复制情况,结果显示,chIRF3/7的过量表达可以有效抑制ALV-J的复制,且Western-blot结果、和TCID50结果均与Real-time PCR结果一致。同时chIRF3/7的过量表达也能够明显上调IFN-β 的上调。这一结果提示,ALV-J在感染宿主细胞的过程中有可能通过干扰chIRF3/7的功能以逃逸宿主的天然免疫。5、ALV-J Env蛋白在抗天然免疫中作用初探ALV-J与其他亚群禽白血病毒相比,其最独特之处就是ALV-J的Env基因,该基因其他亚群之间的同源性极低。且有学者提出ALV-J Env蛋白致病致瘤理论。由此推测,ALV-J Env蛋白在抗天然免疫中是否也发挥一定的作用。本研究成功构建pcDNA3.1-Env真核表达质粒以研究Env蛋白的功能。Real-time PCR结果与双荧光报告素酶结果显示,Env蛋白能够在poly(I:C)刺激后lh、6h和12h抑制IFN-β的表达。Real-timePCR结果显示,在poly(I:C)刺激12h时,TLR3基因表达水平上调,但是IRF3/7和IFN-β3都是处于下调的状态。提示Env蛋白在ALV-J抗天然免疫中可能发挥作用,且Env蛋白发挥作用可能与IRF3/7功能被干扰相关。