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目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种代谢性疾病,随着人们生活水平的提高和环境变化,其并发症的发病率逐年增高。目前人们对糖尿病并发症的研究主要致力于对心、肾、视网膜病变机制的研究,而对肺脏的研究相对较少。高糖经蛋白质非酶糖化、多元醇通路激活、二酰甘油(Diacylglycerol,DAG)-蛋白激酶C(Protein KinaseC,PKC)通路及氧化应激等途径导致转化生长因子–β(tran- sforming growth factor-β,TG F-β)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的激活,MAPK活化增多又可与TGF-β1相互作用影响纤维连接蛋白(fibro nectin , FN)。PKC处于细胞内多条信号通路中心,构成细胞内重要的信息网络系统,参与体内很多生理病理过程。DAG- PKC途径的活化是糖尿病肺损伤的一个重要环节。TGF-β信号在诸如纤维化、癌变、心脑血管疾病等许多重要疾病的病理变化过程中发挥关键性的作用。TGF-β是一类多功能的细胞调控肽,在哺乳动物体内有3种亚型,分别称为TGF -β1 ,TGF -β2 ,TGF -β3。TGF -β1已经被证实与很多肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)病变相关。TGF-β1的活化可使MAP K表达活性增强。MAPK通路是细胞将信号从细胞膜传递到核的主要通路,它是细胞促增殖和传递应激信号的关键激酶。该家族包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、c-Jun氨基端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNLK)、p38MAPK等亚族,其中有实验资料表明p38MAPK在糖尿病肺损伤的形成及发展中起着非常重要的作用。p38MAP K可为DM多种致病因素的共同信号通路的交汇点。本研究应用腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)的方法复制糖尿病大鼠模型观察:1、糖尿病组大鼠肺泡隔增宽,肺间质增加,部分肺泡腔萎缩甚至塌陷;肺泡毛细血管扭曲。2、免疫组织化学法检测肺组织PKC、TGF -β1、FN的表达变化,并对其进行平均光密度分析;3、RT-PCR半定量检测肺组织p38 MAPKmRNA的表达。以明确糖尿病肺组织中PKC、TGF-β1、FN、p38M APK的关系,探讨PKC—TGF-β1—p38MAP K信号传导通路及FN的表达对糖尿病大鼠肺损伤的作用及机制,为糖尿病肺损伤的预防和治疗提供理论依据。方法: 1、实验性大鼠分组及糖尿病模型的复制:60只雄性SD大鼠适应性喂养1周后,随机分为正常对照组(N)及糖尿病模型组(DM)组,每组各30只。DM组大鼠按60mg/kgSTZ溶液一次性腹腔注射,正常对照组腹腔注射等量上述的枸橼酸缓冲液。72h后尾静脉采血测定空腹血糖及定性尿糖,空腹血糖≥16.7mmol/L,尿糖定性≥+++,动物多饮、多食和尿量增加者确定为DM模型。饲养期间实验组和对照组均给予相同的饮食和水。其间未用过包括胰岛素在内的任何治疗,分别在实验第4周、8周末处死大鼠各10只取材。2、血糖及体重测定:采用强生One TouchⅡ型血糖仪,在禁食12小时后,取大鼠尾末稍毛细血管全血测定空腹血糖。并用天平称重大鼠体重、均为每周一次。3、留取肺组织标本进行HE染色、光镜下观察肺组织病理改变。4、糖尿病大鼠肺组织免疫组化分析:对正常对照组及糖尿病组大鼠肺组织切片,进行免疫组化染色。比较不同病程各组大鼠肺组织中PKC、TGFβ-1、FN的蛋白染色情况,采用捷达JEDA801D形态学图像分析系统软件计算每个标本的平均光密度,并对各组的均值进行组间比较。5、糖尿病大鼠肺组织p38MAPK的基因表达:取-80℃保存的新鲜肺组织100mg,利用Trizol一步法提取总RNA,逆转录cDNA,应用PCR方法扩增目的基因p38MAPK,利用β-actin作为内参照,1.5%琼脂糖凝胶电泳后应用MIAS-2000图像分析系统经行灰度测量,结果取目的基因与内参照的比值进行半定量分析。结果: 1、糖尿病组大鼠血糖较同期对照组明显升高、体重明显下降(p<0.01);2、HE染色组织学发现:糖尿病组大鼠肺泡隔增宽,肺间质增加,部分肺泡腔萎缩甚至塌陷;肺泡毛细血管扭曲。3、组织免疫化学染色发现:糖尿病组大鼠肺组织PKC蛋白表达量显著上调,与TGF-β1、FN蛋白表达进行性增多相平行,并随着病程延长逐渐增多。4、p38MAPK mRNA表达糖尿病组比正常组明显增多,统计学有意义。结论: 1、模型组大鼠血糖显著升高,体重显著下降,糖尿病模型复制成功。2、糖尿病组大鼠肺泡隔增宽,肺间质增加,部分肺泡腔萎缩甚至塌陷;肺泡毛细血管扭曲。同时大鼠肺组织中TGF-β1、FN蛋白表达均增加,证实糖尿病肺组织存在纤维化改变。3、糖尿病大鼠肺组织PKC表达显著升高,促进TGF-β1与其受体结合,诱导TGF-β1—p38MAPK信号传导通路中的TGF-β1、p38MAPK表达增多。4、PKC—TGF-β1—p38MAPK信号传导通路中TGF-β1、p38MAPK增多引起FN的积聚,从而促进肺组织纤维化。