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皮肤肿瘤的病因及发病机制一直都是皮肤病学研究领域的热点,大量研究结果显示中波紫外线(ultraviolet B, UVB)是引起皮肤光损伤,甚至诱发皮肤恶性肿瘤的重要原因之一。照射到皮肤表面的95% UVB被角质形成细胞吸收后,可通过直接损伤细胞I)NA、诱导自由基和脂质过氧化产物合成增加、活化细胞膜表面的死亡受体以及激活神经鞘磷脂酶使之降解神经鞘磷脂,导致第二信使神经酰胺及其衍生物增加等方式破坏细胞正常生理功能,从而导致细胞凋亡或死亡。PI3K/Akt/mTOR细胞信号通路是介导细胞增殖、凋亡及分化的重要信号通路之一。研究结果显示UVB通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路而抑制细胞凋亡,使肿瘤细胞增殖及其侵袭性增强是其诱发皮肤肿瘤的重要原因之一。蛋白激酶B(protien kinase B, Akt)在PI3K/Akt/mTOR细胞信号通路活化过程中起重要的作用,而Akt上Ser-473及Thr-308位点的磷酸化又是Akt完全活化的必要条件。然而,UVB诱导Akt活化是否与这两个位点磷酸化的相关性尚不完全清楚。UVB通过直接或间接损伤细胞DNA,诱导基因突变,是其诱发皮肤肿瘤的另一重要机制。因此,DNA损伤后修复在维持基因稳定性方面起到重要作用。非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)是哺乳动物DNA损伤后的主要修复途径。DNA依赖性蛋白激酶(I)NA-dependent protein kinase, DNA-PK)是其重要组成部分,DNA-PK由DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein Kinase catalytic subunit, DNA-PKcs)及两个调节亚基Ku70、Ku80共同组成。研究表明,电离辐射等特定体外刺激可诱导DNA-PKcs活化并激活Akt。同时,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian Target of Rapamycin, mTOR)的其中一种复合物-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mammalian Target of Rapamycin complex 2, mTORC2)也能激活Akt,因此,DNA-PKcs 及mTORC2被认为是Akt活化的重要激酶。然而,UVB辐射是否也能激活DNA-PKcs 及 mTORC2,并进一步诱导Akt活化尚未见报道。因此,本研究旨在进一步探讨UVB激活PI3K/Akt/mTOR细胞信号通路的深层次机制以及被UVB激活的DNA-PKcs及mTORC2进一步活化Akt的主要机制,从而为皮肤癌的防治提供重要靶点。本实验分为四部分：第一部分：UVB激活PI3K/Akt/mTOR信号通路的机制研究方法：1.分别以0、5、15及30mJ/cm2UVB照射人角质形成细胞,1h后,采用Western blot方法检测Akt (Ser-473)、Akt (Thr-308)、mTORC1、GSK3βs9、 S6K (Thr-389)、4EBP-1 以及 mTORC2磷酸化水平。2.以30mJ/cm2UVB照射人角质形成细胞后0min、30min、1h 及 2h,采用Western blot方法检测上述几种蛋白上相关位点磷酸化水平。结果：1.分别以0、5、15及30 mJ/cm2UVB照射人角质形成细胞1h后,Western blot检测结果显示：p-Akt (Thr308)、p-Akt (Ser473)、p-GSK3β、p-mTOR (S2448)、 P-S6K (Thr389)、p-S6 (Ser235/236)及p-Rictor (Tyr1135)的表达随照射剂量增加而增加,呈剂量依赖性,当UVB (30mJ/cm2)照射后,上述因子的表达水平最高(P<0.05)。2.30mJ/cm2UVB照射人角质形成细胞后Omin、15min、30min、1h、2h, Western blot检测结果显示：p-Akt (Thr308)、 p-Akt (Ser473) 及 p-S6K (Thr389)、 p-GSK3p(Ser9)、 p-mTOR(S2448)、p-S6K(Thr389)、 p-S6 (Ser235/236)、p-4E-BP1及p-Rictor (Tyr1135)的表达随时间延长而增加,呈时间依赖性(P<0.05)。结论：UVB通过诱导Akt(Ser-473)、Akt(Thr308)及其下游蛋白上关键位点磷酸化,激活了PI3K/Akt/mTOR信号通路。第二部分：活化的DNA-PKcs及SINl在UVB激活PI3K/Akt/mTOR信号通路中的作用研究方法：1.分别以0、15、30及45mJ/cm2UVB照射人角质形成细胞,5min后,采用Western blot方法检测I)NA-PKcs(Thr-2647)及DNA-PKcs(Thr-2609)磷酸化水平。2.以30mJ/cm2 UVB分别照射沉默了DNA-PKcs后的人角质形成细胞及HaCat细胞和DNA-PKcs(Thr-2609)突变后的人角质形成细胞,1h后,采用Western blot方法检测Akt上两个位点Ser473、Thr308以及Erkl/2磷酸化水平。3.以30 mJ/cm2UVB照射经NU7026(DNA-PKcs抑制剂)预处理后的人角质形成细胞,分别在30min及60min后采用Western blot方法检测Ak(Ser-473) S6(Ser-235/236)及Erkl/2磷酸化水平。4.分别以0、5、15、30及40mJ/cm2UV B照射经NU7026(DNA.PKcs抑制剂)预处理后的人角质形成细胞,24h后,采用MTT法.ELISA方法以及AnneexinV-FITC/PI流式细胞仪检测UVB照射后细胞的存活率及凋亡率。5.以30 mJ/cm2UVB照射敲除了I)NA-PKcs及SIN1的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF),1h后,采用Western blot方法检测Akt(Ser-473)、Akt(Thr-308)磷酸化水平。6.以30mJ/cm2 UVB照射沉默了SIN1的人角质形成细胞,1h后,采用Western blot方法检测Akt(Ser-473)、Akt(Thr-308)以及Erkl/2磷酸化水平。结果：1.以0、15、30、45 mJ/cm2UVB照射人角质形成细胞后5min,Western blOt检测结果显示：p-DNA-PKcs(Thr2647)及p-DNA-PKcs(Thr2609)的表达随照射剂量增加而增加,呈剂量依赖性(P<0.05)。2.30 mJ／cm2UVB分别照射沉默了DNA-PKcs后的人角质形成细胞、HaCat细胞和DNA-PKcs(Thr-2609)突变后的人角质形成细胞,1h后,Westem blot检测结果显示：p-Akt(Ser473)的表达明显减少(P<0.05),而p-Akt(Thr308)及p-Erkl/2的表达未见明显变化(P>0.05)。3.30mJ/cm2 UVB照射经NU7026预处理后的人角质形成细胞,Western blot检测结果显示：p-Akt(Ser473)的表达明显减少(P<0.05),p-0S6(Ser235/236)和p-Erkl/2的表达未见明显变化(P>0.05)。4.5、15、30、40mJ/cm2 UVB照射经NU7026预处理后人角质形成细胞,随照射剂量增加,细胞存活率明显降低,细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。5.30 mJ/cm2 UVB照射敲除了DNA-PKcs及SINl的MEF后,Westem blot检测结果显示：p-Akt(Ser473)表达明显降低(P<0.05),而p-Akt(Thr308)的表达未见明显变化(P>0.05)。6.30 mJ/cm2 UVB照射沉默了SIN1的人角质形成细胞后,Western blot检测结果显示：P-Akt(Ser473)表达水平明显降低(P<0.05),而P-Akt(Thr308)以及p-Erkl/2的表达未见明显变化(P>0.05)。结论：UVB通过诱导DNA-PKcs上Thr2647及Thr2609两个位点磷酸化,激活了DNA-PKcs。DNA-PKcs活性被抑制或DNA-PKcs(Thr-2609)突变后可阻断UVB诱导Akt Ser-473位点磷酸化,并促进细胞凋亡,抑制细胞存活。第三部分：UVB诱导DNA-PKcs-SINl复合物生成的机制研究方法：1.以30 mJ/cm2 UVB分别照射实验组及对照组,其中实验组为沉默了DNA-PKcs、DNA-PKcs(Thr-2609)突变以及经NU7026(DNA-PKcs抑制剂)预处理后的人角质形成细胞,对照组为未经处理的人角质形成细胞,1h后,采用免疫共沉淀方法(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测DNA-PKcs、SIN、Ku80及mTOR的表达。2.以30 mJ/cm2UVB照射人角质形成细胞,分别在照射后0min、15min、30min及1h采用Western blot方法检测细胞质及细胞核中DNA-PKcs、SIN1及Akt的表达。结果：1.采用30 mJ/cm2 UVB分别照射沉默了DNA-PKcs、DNA-PKcs(Thr-2609)突变以及经NU7026(DNA-PKcs抑制剂)预处理后的人角质形成细胞,免疫共沉淀结果显示：在对照组中(未经处理的人角质形成细胞),UVB照射后,DNA-PKcs共沉淀SIN1时,可见SIN1的表达；在SIN1共沉淀DNA-PKcs时,也可见DNA-PKcs表达,但在对照组中,DNA-PKcs共沉淀SIN1时,未见SIN1的表达；在SIN1共沉淀DNA-PKcs时,也未见DNA-PKcs表达。2.30mJ/cm2UVB照射人角质形成细胞后10min、15min、30min及1h, Westernblot检测结果显示：在细胞质中均检测出I)NA-PKcs、SNI1及Akt的表达(P<0.05)。结论：UVB可诱导DNA-PKcs和mTORC2的主要成分SIN1在细胞质中形成DNA-PKcs-SIN1复合物,并介导了UVB对Akt的活化。第四部分：EGFR介导UVB诱导DNA-PKcs/SIN1复合物形成及活化Akt的机制研究方法：1.采用30mJ/cm2UVB照射经AG1478 (EGFR抑制剂)预处理后的人角质形成细胞,通过Western blot方法检测DNA-PKcs、mTOR及Akt (Ser-473)磷酸化水平；通过Co-IP方法检测DNA-PKcs及SIN1的表达。2.采用30mJ/cm2UVB照射敲除了EGFR的MEFs,通过Western blot方法检测DNA-PKcs、mTOR 及 Akt (Ser-473)磷酸化水平；通过Co-IP方法检测DNA-PKcs及SIN1的表达。结果：30 mJ/cm2UVB照射经EGFR抑制剂(AG1478)预处理后的人角质形成细胞及EGFR-KO-MEFs, Western blot检测结果显示：p-Akt (Ser-473)、p-mTOR表达明显降低(P<0.05)。Co-IP检测结果显示：在DNA-PKcs共沉淀SIN1时,SIN1未见表达；而在SINl共沉淀DNA-PKcs 时, DNA-PKcs未见表达(P<0.05)。结论：UVB诱导DNA-PKcs/SIN1复合体的形成需要EGFR的参与。通过本实验,我们阐明了UVB可诱导DNA-PKcs-SIN1复合物合成,而DNA-PKcs-SINl复合物又通过磷酸化Akt (Ser-473)位点,激活Akt,从而促进细胞凋亡,抑制细胞存活。统计学分析：采用SPSS15.0统计软件进行统计分析,计量资料均以均数±标准差(X±S)表示,采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行显著性检验,p<0.05为差异有统计学意义。