黄瓜花叶病毒生物学特性及分子变异研究

来源 :石河子大学 | 被引量 : 7次 | 上传用户:ghosty
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目的:CMV是植物寄主最广泛的植物病毒,严重影响新疆农作物的生产。本文以新疆伊宁和石河子地区采集的加工番茄为主的几种蔬菜为实验材料,从血清学水平、分子水平上阐述CMV在新疆的侵染率、株系分化、重组等分子变异,并从分子水平阐述其卫星RNA的分子变异。同时对部分样品进行CMV的分离纯化,然后对它的生物学特性及分子变异进行研究。最终从生物学、基因组水平上系统阐述新疆地区CMV的株系分化、重组等分子变异,为今后新疆地区培育抗CMV植株提供理论依据。方法:本研究从石河子蔬菜研究所采集南瓜和加工番茄样品中提取dsRNA,以dsRNA为模板利用RT-PCR方法扩增CMV卫星RNA序列和CMV RNA3序列;从新疆石河子和伊宁地区采集了加工番茄、辣椒、番茄、南瓜样品,用CMV亚组型抗体DAS-ELISA和CMV亚组Ⅱ型抗体DAS-ELISA检测;在昆诺藜上单斑分离纯化CMV,并接种植物观察其生物学特性;以RNA为模板采用One-stepRT-PCR技术扩增辣椒等17个样品的RNA3相关序列,采用两步法RT-PCR技术扩增各分离物的全基因组相关序列。结果:克隆自石河子蔬菜研究所的南瓜样品卫星RNA N-sate及加工番茄样品的卫星RNATo-10-sate、S9、S18-1和S18-2的片段大小分别为:335nt、381nt、334nt、396nt和334nt。比对发现5者都不含有引起黄化症状的卫星RNA株系CMVYSAT所具有的黄化区域,且都与国内的分离物相似性较高。伊宁、石河子蔬菜研究所样品的血清型CMV亚组型抗体检出率分别为:加工番茄74.15%(152/205)、辣椒8.6%(2/23)、番茄75%(3/4)、南瓜100%(2/2);CMV亚组Ⅱ型抗体均呈阴性。扩增获得南瓜样品N、YN-8、YN-9,番茄样品YN-2,加工番茄样品To-10和S1-14的RNA3全序列及辣椒样品YN-6、LJ-4、LJ-10和加工番茄样品S1-1、S1-3、S1-4、S1-18、S1-27、S2-76、S2-81、S3-13、S3-47、S3-59的CP全长及MP部分序列,序列分析发现获得的19个序列都与CMV亚组B亲缘关系较近,同时发现从辣椒样品获得的LJ-4和LJ-10与其他样品的CP序列相比相似性较低,表现出较高的变异,并且与X的亲缘关系最近。通过RT-PCR技术获得石河子农市场加工番茄分离物NS0-4和石河子蔬菜研究所辣椒分离物LJ-12的基因组RNA1、RNA2、RNA3全长序列,石河子蔬菜研究所加工番茄分离物S2-58的基因组RNA1、RNA2全长序列和RNA3的部分序列以及农市场米豆分离物M的RNA1全长和RNA2、RNA3的部分序列。全基因组序列分析结果显示:LJ-12分离物基因组序列变异较大,与来自同地区的分离物S2-58都存在亚组内重组现象,而来自另一地区的NS0-4和M基因组却不存在重组现象。症状观察结果显示:NS0-4侵染心叶烟、番茄后出现厥叶症状,心叶烟叶片变脆,番茄植株矮化等症状,而且出现症状较晚;S2-58侵染心叶烟后植株出现叶柄不生长、叶片深绿且呈团座状、叶脆等症状,侵染本氏烟后植株出现叶片深绿、白化斑、轻微皱缩状等症状;M侵染心叶烟后出现黄化、叶片皱缩卷曲、泡突、叶柄变长等症状,侵染本氏烟后植株上显示叶片翠绿色、泡突、皱缩、分支多等症状。结论与推测:对所有研究结果的分析表明:在新疆加工番茄及其它蔬菜上广泛流行的CMV为CMV亚组B,且存在重组、株系分化等分子变异现象,尤其是侵染辣椒植株的CMV;CMV及其卫星RNA的序列多态性与地域有一定的相关性,但是与寄主类别无关;获得的五个卫星RNA序列都不含有CMVYSAT所具有的黄化区域;对于新疆辣椒中CMV的检测应把血清学检测和RT-PCR检测2种方法相结合。根据结果推测:NS0-4MP序列192-501碱基之间309个碱基的缺失不会使CMV完全失去活性,只是在一定程度上影响了CMV的移动;侵染辣椒的CMV发生的这种变异和重组现象,是CMV完成辣椒与其他植株间的扩展所必须的,并且CMV完成辣椒与南瓜、加工番茄、米豆、番茄之间的扩展要比完成后四者之间的扩展要困难。
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