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第一部分：靶向hTERT小片段干涉RNA表达载体的构建和表达【目的】构建靶向hTERT的小片段RNA(siRNA)表达载体，为研究RNA干涉(RNAi)在哺乳动物细胞内抑制靶基因表达奠定基础。【方法】根据siRNA靶点设计的原则运用相关软件设计靶序列并合成其表达框，连接入质粒载体pRNAT-H1.1／Neo，转染293T细胞，荧光定量RT-PCR和western blot法检测转染后293T细胞中hTERT表达。【结果】重组质粒经测序鉴定证明hTERT siRNA转录模板完整、正确插入到pRNAT-H1.1／Neo质粒中，并筛选出一个抑制hTERT表达效率最高的序列，其hTERT表达仅达22.90％。【结论】成功构建并筛选出一个抑制效率最好的靶向hTERT的siRNA表达载体，为以hTERT为靶点的肿瘤基因治疗的后续研究奠定基础。第二部分：靶向hTERT siRNA慢病毒表达载体的构建【目的】通过构建靶向人端粒酶催化亚基(hTERT)RNAi慢病毒载体，获得可供转染的滴度，为下一步研究该基因缺陷在真核细胞中的影响提供物质基础。【方法】根据hTERT设计的两条互补的单链寡核苷酸退火后形成双链插入到pLVTHM质粒，生成含RNAi盒的载体，然后与pCMV-dR8.74和pMD2G病毒包装所必须的元件经脂质体导入T293细胞，包装成慢病毒，收集上清浓缩病毒并检测其滴度。RT-PCR检测干扰后细胞内hTERT表达变化。【结果】将目的序列成功连接到载体上，并经测序分析证实载体构建成功；成功包装成高滴度的慢病毒。RT-PCR和TRAP检测结果证实构建的hTERT-siRNA慢病毒表达载体可显著抑制hTERT基因的表达和端粒酶活性。【结论】成功构建了携带靶向hTERT基因的RNAi慢病毒载体。该载体能够有效抑制hTERT的表达和端粒酶活性，为以hTERT为靶点的胶质瘤基因治疗的后续研究奠定基础。第三部分：慢病毒介导的RNAi技术抑制hTERT表达对U87胶质瘤细胞的作用研究【目的】观测利用RNAi技术下调hTERT表达对U87人脑胶质瘤细胞的影响。【方法】将慢病毒为载体的靶向hTERT siRNA构建体—Lt-I感染U87细胞，含无效序列的慢病毒Lt-non作为空载对照，正常培养U87细胞作为阴性对照。RT-PCR检测hTERT表达，TRAP法检测端粒酶表达，MTT和流式细胞检测分析细胞增殖和周期变化，荧光原位杂交检测端粒长度变化，Transwell法分析细胞侵袭力，观测裸鼠皮下瘤生长。【结果】Lt-I可以明显下调hTERT的表达、端粒酶活性、细胞侵袭力和裸鼠皮下瘤生长。【结论】靶向hTERT的RNAi基因治疗能够抑制hTERT表达、端粒酶活性和细胞侵袭力，这些效应先于肿瘤细胞的端粒长度明显缩短前出现，表明hTERT在胶质瘤发生发展中发挥重要作用，可作为胶质瘤基因治疗的优选靶基因。