猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)是造成猪繁殖障碍的主要病原体之—,导致母猪流产,产死胎、木乃伊胎、畸形胎儿和弱胎。目前,PPV流行范围极广,在世界各个国家均可检到,由于该病毒对外界环境的强抵抗力,猪场感染该病毒后很难将其彻底清除,PPV还与其他病毒发生混合感染造成更严重的影响,因此对该病毒的监控和早期诊断尤为重要。从PPV发现以来对该病毒进行的持续性的检测和研究相对较少,对于PPV感染细胞的机制仍不清楚,因此为了了解猪群中的PPV感染情况,本研究建立了一种能快速、准确检测PPV的荧光定量检测方法,为监测该病毒的流行情况提供技术基础。为了更深入的了解PPV和细胞之间的相互作用,我们利用蛋白质组学技术,对PPV感染不同时间的PK-15细胞进行差异蛋白分析,为探明PPV的感染、致病机制提供数据支撑。1、为了建立一种能快速、准确检测PPV的荧光定量检测方法,本试验针对PPV结构基因VP1设计引物,通过优化实时荧光定量扩增条件建立了一种能快速检测猪群中PPV感染的荧光定量方法。结果显示,该方法特异性、敏感性较高,重复性好,最低检测限为57.2 copy/μL。对来自于流产仔猪和母猪的48份临床样本进行检测,检测阳性率为25%,同时应用实验室已建立的普通PCR方法进行平行检测,阳性率为14.6%,说明该方法的灵敏性高于普通PCR方法,可用于临床猪群中PPV感染的监测。2、为了阐明PPV感染宿主细胞的机制及宿主细胞受到感染时的调节机理,本试验运用蛋白标签定量技术、联合液相色谱串联质谱技术分别对PPV感染PK-15细胞6h和36h的差异表达蛋白质进行定量统计。首先确定PPV的动力生长曲线及对PPV感染PK-15细胞后的不同时间点的细胞病变进行观察,选择PPV感染6h和病毒拷贝数最高且细胞病变明显的时间点分别进行蛋白质组学鉴定。结果显示,PPV在感染细胞36h时病毒粒子拷贝数达到最大,且病变明显,因此后续试验选择PPV感染6h组和36h组样品。经蛋白质组学分析,以倍数变化大于1.5倍(上调大于1.5倍或者下调小于0.67)且Pvalue<0.05为标准筛选差异表达蛋白质,PPV感染6h组共筛选到差异蛋白32个,其中显著上调蛋白21个,显著下调蛋白11个。PPV感染36h后共筛选出差异蛋白345个,其中显著上调蛋白146个,显著下调蛋白199个。3、对差异蛋白进行GO注释、KEGG信号通路富集。结果显示:PPV感染PK-15细胞6h组差异蛋白参与的生物学过程主要包括单有机体过程、细胞内定位、免疫系统过程、细胞迁移、生物附着等,差异蛋白的分子功能主要集中在绑定、催化活性、运输活动等;差异蛋白显著富集信号通路主要涉及细胞生长和代谢、蛋白运输、免疫应答、细胞骨架改变等。PPV感染PK-15细胞36h组差异蛋白参与的生物学过程主要集中在代谢过程、细胞内定位、免疫系统过程、细胞迁移、细胞杀伤等,差异蛋白的分子功能主要集中在绑定、催化活性、运输活动、分子功能调节等;差异蛋白显著富集到的信号通路主要涉及细胞间信息传导、蛋白修饰、RNA修饰、免疫过程等。4、为比较PPV感染PK-15细胞后不同时间点的蛋白质表达差异,及差异蛋白参与的主要生理过程,将PPV感染6h和36 h时鉴定到的蛋白进行分析,以倍数变化大于1.5倍(上调大于1.5倍或者下调小于0.67)且P value<0.05为标准筛选差异表达蛋白质,结果显示:共筛选到差异蛋白187个,PPV感染36h和6h相比上调蛋白120个,下调蛋白67个,差异蛋白参与的生物学过程主要包括在单有机体过程、代谢过程、细胞成分组织发生、免疫系统过程、细胞杀伤等,显著性富集的通路主要包括类固醇生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸转换、黏着连接、内吞作用、剪接体等,说明PPV在感染6 h和36 h相比在生物合成、细胞骨架、RNA的加工等方面存在明显差异。