乙酰化是一种高度保守的蛋白质可逆性翻译后修饰,其广泛存在于组蛋白和非组蛋白中,对蛋白的功能和稳定性有着极其重要的作用。Bm30K蛋白是家蚕血淋巴蛋白中主要成分之一,参与家蚕的许多生理过程,如能量储藏、脂肪运输、胚胎发育和免疫反应等。此外,Bm30K蛋白对细胞具有一定的抗凋亡作用。前期通过乙酰化肽段富集技术和nano-HPLC/MS/MS鉴定了家蚕总蛋白的乙酰化位点,鉴定结果显示多种营养储藏类蛋白如Bm SP2、Bm Apo Lp-III和Bm30K-3存在大量乙酰化修饰位点,进一步前期研究表明,乙酰化修饰可以调控Bm SP2、Bm Apo Lp-III和Bm30K-3蛋白的稳定性。Bm30K-15蛋白是家蚕血淋巴中含量丰富的一种低分子量载脂蛋白,前期鉴定Bm30K-15蛋白在第98位赖氨酸存在乙酰化修饰,鉴于以上研究,本论文开展了乙酰化修饰对家蚕Bm30K-15蛋白稳定性的影响及其机制的研究。首先,成功构建了重组真核表达载体p IEX-1-Si-GFP-Bm30K-15并鉴定过表达Bm30K-15蛋白的乙酰化。将重组表达载体p IEX-1-Si-GFP-Bm30K-15转染至Bm N细胞中,利用6×His和乙酰化单抗,通过免疫共沉淀(IP)和Western blotting法检测Bm30K-15蛋白的过表达及乙酰化修饰水平,结果表明过表达Bm30K-15蛋白被高度乙酰化。其次,用乙酰化酶抑制剂C646和去乙酰化酶抑制剂Cocktail、LBH589处理转染p IEX-1-Si-GFP-Bm30K-15的Bm N细胞并收集处理后的Bm N细胞。研究表明C646处理的细胞中Bm30K-15蛋白表达量降低,而Cocktail和LBH589处理的细胞中Bm30K-15蛋白表达量增高。进一步q RT-PCR实验结果发现经C646,Cocktail和LBH589处理后Bm N细胞中Bm30K-15的m RNA水平变化差异不明显。以上结果表明,乙酰化修饰水平变化可以影响Bm30K-15蛋白的表达,表达可随着乙酰化修饰水平提升而增高,且这种乙酰化修饰对蛋白表达的上调是在转录后翻译水平上进行的。最后,使用蛋白合成酶抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132分别处理经Cocktail、LBH589处理后提升乙酰化水平的细胞,结果显示乙酰化水平提升后Bm30K-15蛋白在Bm N细胞中的降解减弱,胞内积累增加,表明乙酰化可以使得Bm30K-15蛋白的稳定性增强。同时进行乙酰化与泛素化竞争实验,结果显示乙酰化水平的上调可以降低其泛素化水平。综合分析上述结果,表明Bm30K-15蛋白的乙酰化修饰可以和其泛素化修饰竞争,抑制泛素介导的蛋白酶体降解途径,从而提高Bm30K-15蛋白的稳定性。此外,本课题还构建了Bm30K-15蛋白原核表达载体p ET-28a(+)-Bm30K-15,并将其转化到大肠杆菌BL21表达Bm30K-15蛋白,最后将纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔,得到特异性和效价合格的抗Bm30K-15蛋白多克隆抗体,为后续在细胞中进一步鉴定Bm30K-15蛋白的功能奠定了基础。在本研究中,我们发现家蚕营养储藏类蛋白Bm30K-15通过乙酰化修饰和泛素化修饰之间的竞争抑制关系影响其蛋白的稳定性,这有助于阐明营养储藏类蛋白介导的家蚕营养储藏和水解利用的分子机制。