论文部分内容阅读
目的:酒精性肝病（Alcoholic liver diseases,ALD）是由于过度摄入酒精引起的一系列肝脏病变,包括最先以脂肪变性为典型病理特征的酒精性脂肪肝到酒精性肝炎、纤维化、硬化和肝癌,在此过程中常继发酒精性肝铁过载,进一步加剧了ALD病程。在全球酒精消费仍在不断攀升的今天,深入阐明ALD发病机制,纠正酒精引起的肝脏脂质代谢紊乱,同时防止肝铁沉积,可能才会更有效地防止ALD的发生发展。Rab7作为调控囊泡运输和溶酶体质量控制的关键蛋白,在脂噬后期自噬小体与溶酶体融合过程中发挥重要作用,同时在铁摄取及溶酶体铁输出过程中发挥调控作用,但能否调控酒精诱导的铁脂代谢紊乱仍有待探究。槲皮素是一种常见的膳食来源的黄酮类天然植物化学物,具有调节铁、脂代谢及抗炎、抗氧化等广泛的生物学活性,对ALD也有着良好的保护效应,但其作用是否也与Rab7功能调控相关,目前无相关报道。为此,本研究以Rab7为核心,探讨其对膜融合、V-ATPase和线粒体-溶酶体膜接触位点（Membrane contact sites,MCSs）的作用对肝脏酒精性脂质和铁沉积的影响,以及槲皮素通过Rab7发挥ALD保护作用的相关机制。方法:8周龄的雄性C57BL/6J小鼠按体重随机分为正常对照、ALD模型、槲皮素干预和槲皮素对照,共4组。动物建模参照Gao-binge（chronic plus binge ethanol feeding）改良模型,即小鼠以乙醇供能28%的Lieber De Carli液体饲料慢性喂养12周后进行单次大剂量酒精（5 g/kg.bw）灌胃;对照组正常Lieber De Carli液体饲料喂养12周后等能量的麦芽糊精灌胃;槲皮素按100mg/kg.bw给予12周。灌胃9小时后处死小鼠,检测各组血清转氨酶水平与血清和肝脏甘油三酯（Triglyceride,TG）水平;光学和透射电镜观察肝组织结构病变;免疫荧光共定位检测肝脏脂噬流;Western blot检测膜融合和自噬相关蛋白及线粒体呼吸链复合物（Mitochondrial respiratory complex,MRC）蛋白水平;原子吸收法检测肝组织总铁和可变铁池（Liable iron pool,LIP）水平;Iron assay kit比色法检测动物溶酶体铁水平。以转染CYP2E1质粒的HepG2细胞和小鼠正常肝细胞系AML12细胞为对象,在酒精（100 mmol/L）和槲皮素（50μmol/L）处理48小时的同时,加入Rab7抑制剂CID1067700（80μmol/L）或用不同剂量的V-ATPase抑制剂Bafilomycin A和Concanamycin A处理细胞,或预先对细胞进行Rab7敲低与过表达(野生型Rab7Wt、持续活化型Rab7Q67L、失活型Rab7T22N)处理。溶酶体（Lyso Traker）与脂滴(BODIPY493/503)荧光共定位检测脂噬;转染双荧光质粒（m Cherry-GFP-LC3）检测自噬流;Western blot检测膜融合相关蛋白和自噬相关蛋白及MRC水平;特异性荧光探针法测定细胞内ROS、LIP及溶酶体p H值、铁和膜通透性（Lysosomal membrane permeability,LMP）;Ed U检测细胞增殖能力;活细胞激光共聚焦荧光淬灭恢复（fluorescence recovery after photobleaching,FRAP）实验检测Rab7膜周转能力;转盘共聚焦观察活细胞线粒体-溶酶体MCSs和线粒体形态。STRING平台检索Rab7相关蛋白并用Cytoscape可视化,通过Genecards（https://www.genecards.org/）对筛选出的相关蛋白进行功能注释,进一步通过动物细胞实验验证。结果:1.与正常对照组相比,Gao-binge酒精喂养小鼠转氨酶水平升高,肝脏和血清TG水平升高,LC3与脂滴膜包被蛋白PLIN2和溶酶体膜蛋白LAMP2共定位减少,肝总铁、LIP、溶酶体铁显著升高（P＜0.05）,线粒体-溶酶体MCSs解离障碍。槲皮素干预后部分逆转了酒精暴露导致的转氨酶升高、脂质和铁沉积、脂噬水平降低和线粒体-溶酶体MCSs解离障碍。2.酒精暴露导致小鼠肝脏GTP-Rab7显著降低75%（P＜0.05）,溶酶体与脂滴共定位减少,自噬流受阻（m Cherry-GFP-LC3显示黄色荧光增多）,溶酶体LMP升高、p H水平升高,成熟的组织蛋白酶D蛋白水平降低;槲皮素干预后,ALD小鼠肝脏上述指标明显逆转。3.细胞转染Rab7野生型质粒(Rab7Wt)显著恢复了由于酒精处理导致的溶酶体与脂滴共定位降低、自噬流受阻、TG和胆固醇（Cholesterol,TC）水平的升高和总铁及溶酶体铁水平的升高,转染持续活化形式的Rab7(Rab7R67L)发挥的保护作用低于Rab7Wt,而失活型Rab7T22N对酒精诱导的细胞损伤没有保护作用;槲皮素干预使酒精处理的HepG2细胞Rab7活化水平在条件下升高71%（P＜0.05）,恢复酒精暴露导致的上述损伤;Rab7抑制抵消了槲皮素对酒精诱导的细胞损伤的保护作用;FRAP结果表明酒精暴露降低Rab7的周转能力,槲皮素干预有助于Rab7周转能力的恢复。4.酒精孵育降低转染了CYP2E1的HepG2细胞V-ATPase亚基V1G1蛋白水平（P＜0.05）,由此引起细胞溶酶体酸化能下降、LMP升高和成熟的组织蛋白酶D蛋白水平下调,同时伴有细胞总铁和溶酶体铁升高。Rab7抑制进一步加剧了酒精引起的V1G1下调（P＜0.05）和铁沉积;槲皮素部分恢复由于酒精暴露导致的溶酶体损伤和铁沉积,但这种保护作用同样被Rab7抑制所抵消;V-ATPase抑制剂Concanamycin A导致胞内铁和溶酶体铁水平升高,并伴随着IRP2和HIF1α蛋白水平升高、ROS水平升高、线粒体铁硫簇蛋白合成减少、线粒体结构损伤且数量减少。槲皮素干预通过Rab7恢复V-ATPase水平,从而减少酒精暴露导致的胞内铁沉积。5.通过STRING检索和基因功能注释探究Rab7相互作用蛋白及其功能,发现与Rab7最为相关的10个相互作用蛋白主要分为膜融合蛋白和参与囊泡逆行转运的的相关蛋白两类,其中TBC1D5与Rab7的周转能力高度相关。Gao-binge酒精喂养和酒精孵育分别导致小鼠肝脏和转染了CYP2E1的HepG2细胞TBC1D5蛋白水平降低,而槲皮素干预可以恢复TBC1D5蛋白水平。转盘共聚焦检测由TBC1D5-Rab7周转介导的线粒体-溶酶体MCSs的动态改变,结果显示:酒精暴露导致线粒体-溶酶体MCSs解离障碍;槲皮素通过Rab7恢复酒精组线粒体-溶酶体MCSs解离障碍,进而恢复线粒体呼吸复合物和FECH的蛋白水平,减轻线粒体损伤并恢复细胞的增殖能力。结论:Gao-binge酒精喂养抑制肝脏Rab7周转导致脂噬受阻的同时,下调V-ATPase亚基V1G1蛋白水平并引起线粒体-溶酶体MCSs解离障碍;V-ATPase抑制导致了铁沉积且伴随铁利用障碍,致使线粒体受损。槲皮素干预可以通过恢复Rab7周转能力改善酒精暴露导致的脂噬降低、铁沉积、线粒体-溶酶体MCSs解离障碍和细胞增殖能力降低。酒精暴露导致调控Rab7膜周转的GAP蛋白TBC1D5蛋白水平降低,而槲皮素可以恢复TBC1D5水平进而调控Rab7周转。