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番茄是世界上栽培最广泛,年产量最高的蔬菜作物之一,也是遗传学和生物工程等学科研究中的重要对象和模式植物,其研究结果常常被借鉴用于其他作物上。截至1997年底,全世界共有48个转基因番茄品种进行商业化生产。目前,利用番茄作为生物反应器生产植物疫苗、基因工程药物和功能食品的研究正成为番茄基因工程研究的一个热点。而纳豆激酶是一种由纳豆枯草杆菌(Bacillus natto)产生的具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶,其来源于日本的传统食品—纳豆(natto)。国内外的研究结果表明,NK可有效地分解血栓的主要成分——纤维蛋白,极有可能开发成为新一代理想的溶栓药物。因此,本试验旨在建立根癌农杆菌介导的高效的番茄遗传转化体系,为用植物作为生物反应器来获取纳豆激酶蛋白提供一条新途径,现取得的研究成果如下: 1. 根据GeneBank里公布的纳豆激酶基因序列设计引物,并分别在两端增加了BamHI酶切位点,利用纳豆芽孢杆菌菌液进行PCR 反应,通过试剂盒回收纯化提取NK 基因,并和PBST 载体连接,从而成功地克隆到了纳豆激酶基因;测序结果表明,克隆的NK 基因大小为1143bp,共编码381 个氨基酸,其与GeneBank 中报道的序列(AF368283)同源性达到99.7%以上,产生突变的3 个碱基,并没有影响到纳豆激酶的纤溶活性。 2. 利用质粒pBPC47、质粒pCAMBIA1300 和质粒pMG15 进行纳豆激酶基因NK 表达载体的构建。PCR 反应和酶切检测证明,目的基因片段正向插入载体pCAMBIA1300,从而成功的构建了表达载体pCAMBIA-nk。 3.采用经典冻融法转化pCAMBIA-nk 表达质粒,将其导入到农杆菌LBA4404 中;并利用农杆菌介导作用,将质粒pCAMBIA-nk 导入番茄,通过潮霉素筛选得到了大量的抗性愈伤组织,并进一步进行分化、生根、炼苗培养,最终得到了7 株再生番茄苗,转化率最高达到7.52‰。 4. 以载体质粒DNA 为阳性对照,未转化植株DNA 为阴性对照,对得到的再生植株进行PCR 反应。检测结果表明:有7 株扩增出1146bp 的条带,与质粒扩增出的条带位置相同,初步说明外源基因NK 已整合到番茄基因组中。