女性的卵巢是产生卵子和分泌性激素的性腺，具有生育和内分泌双重功能，是人类社会繁衍后代和维持女性健康生理状态的重要器官。但卵巢又是一个对内外环境变化极敏感的器官，易受各种理化因素的损害。临床上许多治疗措施，如恶性肿瘤病人的放、化疗，自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮)的免疫抑制治疗，以及骨髓移植前的化疗都可损伤卵巢，出现月经紊乱、围绝经综合征、不孕甚至卵巢功能永久性衰竭等一系列改变，研究表明化疗药物对卵巢的损害是不可逆的，暴露于化疗药物的卵巢，其组织病理可显示出从卵泡数目的严重减少到缺失，最终引起功能衰竭。据报道，64％的成年女性患者经历肿瘤治疗后伴随有一种或多种卵巢功能衰退的症状。另一方面，随着医学的进步，青少年和生育年龄的女性癌症患者在经过治疗后，生存率显著提高。据估计，到2010年每250个成年人当中就有一个是青少年癌症患者治疗后的幸存者，因此在治疗疾病的同时如何保存这些女性的生育和内分泌功能越来越成为一个迫切需要解决的问题。　　 目前，大量研究表明抗肿瘤治疗中导致卵巢功能损害的机制是细胞凋亡，由于颗粒细胞与卵母细胞的凋亡，作为卵巢内最基本功能单位的卵泡也随之消亡，最终导致卵巢生殖与内分泌功能的丧失。研究还发现神经酰胺(ceramide)作为脂质第二信使在卵泡细胞凋亡信号中扮演重要的角色。在受到伤害刺激后，颗粒细胞与卵母细胞内神经酰胺水平迅速升高并诱导细胞凋亡，并且神经酰胺水平的增高主要是由于酸性鞘磷脂酶1(Sphingomyelin phosphodiesterase1，SMPD1)的表达增强以及活化，消解细胞膜神经鞘磷脂所致。研究表明敲除SMPD1基因的小鼠卵母细胞表现出对化疗药物诱导凋亡的抵抗。而TILLY等人的研究发现神经酰胺的拮抗剂神经鞘氨醇-1-磷酸盐(sphingosine1-phosphate,S-1-P)能够有效抵制由抗肿瘤药物所诱发的卵泡丢失。而且用射线对雌性小鼠进行照射前用S-1-P能够以剂量依赖的方式保护接受辐射小鼠卵巢的功能，收集在接受放射前使用S-1-P处理过的小鼠卵子进行体外受精、胚胎培养结果显示受精率与胚胎发育与正常卵子没有差异。而我们课题组之前的实验研究也得出S-1-P能预防环磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)导致的大鼠卵巢功能损害，其抗凋亡作用可能是通过调节Bcl-2家族成员表达而实现。　　 上述研究证实SMPD1是卵巢发育过程中卵泡池储备减少和抗肿瘤治疗中卵泡凋亡的关键调控因素的同时也为寻求卵巢功能保护的方法提供了新的作用靶点。可以利用基因调控技术手段来沉默SMPD1基因的表达，阻断凋亡信号传导通路，从而降低放/化疗过程中卵泡凋亡，进而达到卵巢保护的目的。RNA干扰技术(RNA Interference)是通过双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)介导，序列特异性降解目的基因的信使RNA(mRNA)，实现转录后快速、高效、精确沉默基因的表达，而不影响基因组序列。因此，设计利用siRNA技术沉默SMPD1基因的表达，阻断卵泡细胞内凋亡信号传导，降低放/化疗过程中卵泡凋亡，从而达到保护卵巢功能的目的。siRNA作为药物用于疾病治疗，首先需要把siRNA分子在体内输送靶细胞的胞浆内。而动物实验中常用的静脉高压注射缺乏组织特异性，而局部组织的直接注射在人体内实施也较困难。Song等人利用HIV感染的CD4+T淋巴细胞表面特异性表达GP120蛋白的特点，构建了抗GP120单克隆抗体与鱼精蛋白的融合蛋白，利用鱼精蛋白所带正电荷与带负电荷的siRNA结合，血管内注射后，融合蛋白携带抗HIV的siRNA进入HIV感染的淋巴细胞，而对没有发生感染的淋巴细胞没有影响。　　 受上述研究启发，我们利用卵巢组织颗粒细胞表面的特异性受体-卵泡刺激素受体(Follicle-Stimulating Hormone Receptor,FSHR)来介导siRNA靶向运输到卵巢组织发挥抗凋亡的作用。FSHR主要在初级卵泡颗粒细胞上表达，随着卵泡的发育，颗粒细胞上FSHR数量逐步增加，卵泡刺激素(Follicle-Stimulating Hormone，FSH)通过与受体的特异性结合，并在雌激素和黄体生成素(LuteinizingHormone,LH)的协同作用下促使卵泡发育成熟，在正常生理情况下，在其它组织细胞上尚未发现FSHR的表达。在分子结构上,FSH与LH、绒毛膜促性腺激素(Chorionic Gonadotropic,CG)、促甲状腺激素(Thyroid-StimulatingHormone,TSH)一样，均由α、β两个亚基组成，其中α亚基为上述4种激素所共有，由同一基因编码，而β亚基则由不同基因编码，这决定上述分子结构的特异性与生理功能的差异。故理论上设计以FSHβ亚基为siRNA载体，实现特异性靶向介导siRNA进入卵巢组织应该是可行的。　　 研究目的：　　 1.FSHβ亚基与鱼精蛋白1融合基因插入质粒pcDAN3.1+，构建含FSHβ亚基与鱼精蛋白1融合基因的重组质粒pcDAN3.1+/FSHβ-(GS)-P1。重组质粒转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，构建CHO细胞真核表达系统，表达富含正电荷的融合蛋白FSHβ-(GS)-P1。　　 2.融合蛋白FSHβ-(GS)-P1与针对小鼠SMPD1基因的siRNA非共价结合，靶向介导siRNA沉默卵巢颗粒细胞SMPD1基因的表达。　　 材料与方法：　　 1.重组质粒构建：在Pubmed中查出小鼠FSHβ亚基和鱼精蛋白1的编码序列，去除FSHβ亚基编码序列终止密码子后，通过柔性肽(GSGGSG)编码序列与鱼精蛋白1的编码序列5'端拼接在一起，获得融合蛋白FSHβ-(GS)-P1的编码序列。同时在融合蛋白编码序列5'端加入KOZAK序列(GCCACC)及甘氨酸编码序列(GGT)，3'端加入6个组氨酸标签的编码序列，整个编码序列的5'和3'端再分别加入ECORⅠ和BamHI限制性酶切位点及3个保护性碱基。化学合成该重组的目的基因，插入质粒pcDAN3.1+，获得重组质粒pcDAN3.1+/FSHβ-(GS)-P1。　　 2.重组质粒pcDAN3.1+/FSHβ-(GS)-P1转化大肠杆菌后筛选阳性受体菌，进行重组质粒DNA扩增、提取及酶切电泳鉴定。　　 3.重组质粒转染CHO细胞，G418(1000μg/ml)筛选出稳定分泌表达FSHβ/P1融合蛋白的单克隆CHO重组细胞。通过RT-PCR、免疫细胞化学(ICC)、Western blot、ELISA鉴定融合蛋白的表达。　　 4.含FSHβ/P1融合蛋白的CHO重组细胞培养上清液介导荧光标记siRNA进入卵巢颗粒细胞内，在荧光显微镜下观察颗粒细胞内的荧光强度，同时用Lipofectamine2000(lipo2000)介导siRNA转染颗粒细胞作为阳性对照，对比融合蛋白转染siRNA效率。　　 5.Real Time RT-PCR检测经FSHβ/P1融合蛋白介导进入颗粒细胞的siRNA沉默目的基因SMPD1效率。　　 结果：　　 1.成功构建含FSHβ/protamine1融合蛋白的重组质粒DAN3.1+/FSH-(GS)-P1。　　 2.重组质粒pcDAN3.1+/FSHβ-(GS)-P1成功扩增并经酶切电泳鉴定，证实了酶切所得的基因片段大小与理论值相符，约600bp左右。　　 3.成功构建了表达融合蛋白FSHβ-(GS)-P1的单克隆CHO重组细胞。对重组细胞所提总RNA进行RT-PCR，重组cDNA特异性引物扩增所得DNA产物大小及碱基序列经测序与理论值完全一致。免疫细胞化学鉴定融合蛋白定位于CHO重组细胞胞浆内。Western blot鉴定融合蛋白的分子量大约为21KD。ELISA鉴定融合蛋白可存在于CHO重组细胞培养上清液里，在细胞中呈分泌性表达。　　 4.含有融合蛋白的CHO重组细胞培养上清液成功特异性介导siRN进入卵巢颗粒细胞内，而且转染siRNA的效率高于Lipofectamine2000。　　 5.Real Time RT-PCR结果显示含FSHβ/protamine1融合蛋白的重组细胞上清介导siRNA进入颗粒细胞能够沉默目的基因SMPD1表达，SMPD1基因的mRNA平均下降了50.05％。　　 结论：　　 1.成功构建FSHβ/protamine1融合蛋白真核表达系统，重组CHO细胞能稳定分泌性表达融合蛋白。2.FSHβ/protamine1融合蛋白能特异性介导siRNA进入卵巢颗粒细胞内，兼有FSHβ亚基与卵巢颗粒细胞特异性结合的特性和鱼精蛋白富含正电荷与带负电荷的siRNA结合的活性。　　 3.FSHβ/protamine1融合蛋白高效靶向介导针对SMPD1基因的SMPD1 siRNA进入颗粒细胞内，并能在mRNA水平沉默目的基因SMPD1的表达，沉默效率高于lipo2000，但仍有待提高。