包涵体蛋白如何在体外高效地重折叠复性是基因工程蛋白产业化过程的难点之一,特别是一些富含二硫键的重组蛋白的体外重折叠复性更是国内外科研工作者的研究重点。二硫键形成蛋白A （disulfide bond formation protein A, DsbA）是一种存在于大肠杆菌间周质的协助新生肽链正确折叠并形成正确二硫键配对的重要功能性蛋白质之一。本文以重组DsbA的发酵、纯化及其协助模型蛋白溶菌酶进行体外重折叠复性为主线,开展了以下五方面的工作：其一,通过统计方法对重组DsbA发酵与纯化进行优化；其二,游离DsbA协助溶菌酶体外重折叠复性条件的考察与动力学模拟；其三,固定化DsbA协助溶菌酶的批式复性；其四,固定化DsbA和复合柱协助溶菌酶的柱上复性；其五,用分子模拟的手段模拟了溶菌酶在水环境高温下以及8M尿素环境高温下的变性情况。重组DsbA发酵与纯化的优化：采用Plackett-Burman设计从诸多的培养基组分和操作条件中筛选出影响DsbA表达量最大的4个因素：培养基中NH4Cl浓度、诱导剂IPTG终浓、培养温度和诱导后培养时间。再利用杂合设计及约束优化的方法求得发酵过程的最优参数,优化后重组DsbA的表达量较基础培养条件下提高51.9%,达到390.4±1.8 mg/L发酵液。进一步采用Box-Behnken设计和多目标规划的方法优化了DsbA纯化过程中系统pH、洗脱DsbA时的盐浓度、平衡缓冲液中的初始盐浓度以及上样量4个操作参数,使得离子交换层析过程的蛋白回收率达到96.8%,浓度为962.2 μg/ml。综合优化的重组DsbA发酵和纯化过程,最终重组DsbA的产量为377.9±1.7mg DsbA（纯度>95%）/L发酵液。游离DsbA协助溶菌酶体外重折叠复性条件的考察与动力学模拟：运用Plackett-Burman设计,从复性过程的主要参数中筛选出对蛋白收率和复性后比活影响最大的4个因素：初始溶菌酶浓度、尿素浓度、GSSG浓度、KCl浓度。再利用小型中心复合设计及多目标规划方法求得最优参数,使游离DsbA协助溶菌酶体外复性的蛋白回收率为99.7%,比活为25,600 U/mg。建立了溶菌酶复性动力学模型,考察尿素浓度、KCl浓度、GSSG浓度、DsbA与溶菌酶摩尔比及溶菌酶初始浓度等因素对DsbA协助溶菌酶游离复性动力学的影响,拟合动力学参数k2、k3以及k2/k3,且各模型回归相关系数基本都在0.99以上,模型拟合良好。固定化DsbA协助溶菌酶的批式复性：将纯化后的DsbA蛋白固定化于NHS-activated Sepharose Fast Flow凝胶上,固定化率约为5.3 mg DsbA/ml湿胶。考察了不同的溶菌酶复性初始浓度、复性温度、复性pH、尿素浓度、KC1浓度以及氧化还原环境对固定化DsbA协助溶菌酶体外复性的影响,并与溶菌酶稀释复性过程进行了比较。固定化DsbA在协助复性完成后,可以通过离心的方式回收再利用,经过3次重复利用,溶菌酶的活性回收仍能维持在82.5%,但重复使用4次后,溶菌酶的活性损失明显。固定化DsbA和复合柱协助溶菌酶的柱上复性：将5 ml固定化DsbA填装入层析柱,在优化操作条件下,上样1.6 mg溶菌酶,柱上复性能得到4.2 ml浓度为369 μg/ml复性后的溶菌酶,活性收率达到95.7%。将该固定化DsbA层析复性柱在相同的操作条件下重复利用10次,前4次仍能维持很好的复性效果,第5次溶菌酶活性下降到初始的78%左右。在此基础上,在固定化DsbA层析复性柱前端再装填1 ml以Sephadex G-100为填料的SEC柱,构建复合层析复性柱。其上样量可以提高到2.4 mg,柱上复性最终可得到4.2 ml浓度为542 μg/ml的复性后的溶菌酶,活性收率达到92.7%。将该复合柱多批次应用于溶菌酶的柱上复性,上样量进一步提高到2.8 mg变性溶菌酶,上样体积为0.5 m1,经过10批次复性过程,前6次都能保持很好的复性效果,第10次仍然能达到初始酶活的70%左右,较固定化DsbA复性效果有较大的改进。用分子模拟的手段模拟了溶菌酶在水环境高温下以及8M尿素环境高温下的变性情况：通过分子模拟的手段,考察了溶菌酶分子在500 K、700 K和900K温度下的热变性。3个重要的参数包括均方根偏差RMSD.氢键数目Nh和分子回转半径Rg都能明显地反映出溶菌酶分子随时间越来越伸展偏向去折叠状态。对比溶菌酶分子在水溶液和8 M尿素溶液中700 K温度下的热变性,在有尿素存在的系统中,溶菌酶的肽链伸展得更明显。总之,全文围绕着重组DsbA制备、纯化及其在协助溶菌酶体外重折叠复性中的应用中开展了系统的研究,对DsbA协助富含多对二硫键蛋白质复性机理进行了探讨,为进一步将DsbA应用于富含二硫键的包涵体蛋白系统中奠定了基础。