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金黄色葡萄球菌是临床常见的引起化脓性感染的病原体，耐药性的产生和持留菌的形成是临床治疗金黄色葡萄球菌感染所面临的挑战。目前有关金黄色葡萄球菌持留菌的形成机制尚未十分明确，因此，探究其持留菌的形成机制对于针对性治疗有着十分重要的意义。本课题基于发现金黄色葡萄球菌不同生长期的菌体密度不同，相应的持留程度也不同这一表型现象，探讨了细菌密度对持留菌形成的影响，利用转录组测序及相关基因敲除来探讨相关分子机制。
目的：
探讨菌液中的细菌密度对金黄色葡萄球菌持留菌形成的影响及分子机制。
方法：
1.将PBS洗涤后的对数期金黄色葡萄球菌Newman株菌液进行100倍浓缩，稳定期菌液进行1000倍稀释后制备成低密度菌液(对数期菌液和稳定期稀释菌液)和高密度菌液(稳定期菌液和对数期浓缩菌液)，放置6小时后，选用氨苄青霉素(10μg/mL)、诺氟沙星(200μg/mL)、庆大霉素(200μg/mL)和万古霉素(100μg/mL)进行抗生素暴露试验，测定不同生长期不同密度金黄色葡萄球菌菌液中持留菌的形成状况。同时进行低密度菌液和高密度菌液处理后立即开展抗生素暴露试验，测定菌液持留菌形成的变化。
2.将培养至稳定期的金黄色葡萄球菌菌液分别进行1:10、1:1000和1:100000稀释，选用氨苄青霉素、诺氟沙星、庆大霉素和万古霉素进行抗生素暴露试验，测定不同稀释度的稳定期金黄色葡萄球菌持留菌的形成状况。
3.开展低密度细菌和高密度细菌的饥饿实验，测定饥饿环境下密度对持留程度的影响；依据菌液稀释度，加入过氧化氢开展氧化应激试验，测定菌液密度的变化对金黄色葡萄球菌抗氧化能力的影响。
4.测定1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000和1:1000000倍稀释接种的金黄色葡萄球菌的生长曲线，以1:1000稀释接种的金黄色葡萄球菌菌液培养至5小时时的细菌数目为依据，从生长曲线上确定菌液1:100、1:10000、1:100000、1:1000000稀释接种后生长至相近菌量所需的时间，选取该时间点的前后各一个时间点进行氨苄青霉素暴露试验，测定各时间点金黄色葡萄球菌持留菌的形成能力。
5.收集金黄色葡萄球菌对数期和对数期浓缩菌液、稳定期和稳定期稀释菌液，采用Trizol法抽提总RNA，利用转录组测序(RNA-seq)测定不同生长期不同密度菌液中基因组转录水平，Q-PCR验证结果，并采用生物信息学分析，探讨密度影响金黄色葡萄球菌持留形成的分子机制。
6.利用同源重组技术，选用质粒pMX10，构建金黄色葡萄球菌基因敲除株ΔNWMN_2288。观察和对比ΔNWMN_2288在TSA上的生长状况及甘露醇发酵能力变化；通过开展野生株和ΔNWMN_2288的氨苄青霉素和诺氟沙星暴露试验，观察NWMN_2288对金黄色葡萄球菌不同生长期和不同密度菌液持留菌形成的影响。
结果：
1.对于浓缩或稀释后放置6小时的高密度菌液和低密度菌液，致死浓度的氨苄青霉素、诺氟沙星、庆大霉素、万古霉素均可以很好地杀伤低密度菌液(对数期/稳定期稀释)中的细菌，在药物分别作用5/3、1/2、3/1和4/2天后能够完全清除低密度细菌；而两种高密度菌液(对数期浓缩/稳定期)中的细菌均呈现出对药物的耐受性，氨苄青霉素和万古霉素对两种菌液作用10天均未能完全杀灭，诺氟沙星和庆大霉素分别作用6/7和6/7天才能够完全清除高密度细菌。密度改变处理后立即加药的不同密度菌液也显示出对抗菌药物类似的敏感性和耐受性。
2.不同稀释度的金黄色葡萄球菌稳定期菌液显示出不同的抗菌药物耐受性，其中1:10稀释后的细菌需氨苄青霉素和万古霉素作用8天才能够完全被清除，诺氟沙星和庆大霉素需作用5~6天才能够完全被清除；1:1000稀释后的细菌需氨苄青霉素和万古霉素作用2~4天即可完全被清除，诺氟沙星和庆大霉素需作用1~2天即可完全被清除；1:100000稀释后的细菌除氨苄青霉素需作用2天可完全被清除外，万古霉素、诺氟沙星和庆大霉素需作用1天即可完全清除细菌。
3.饥饿试验结果显示，对数期和对数期浓缩菌液及稳定期菌液在饥饿环境作用20天后均仍有许多细菌存活，而稳定期稀释菌液在饥饿环境中14天后全部死亡。过氧化物应激试验结果显示，金黄色葡萄球菌耐受试验浓度的过氧化氢的能力不同，对低密度菌液的杀伤作用强于高密度菌液。
4．生长曲线显示，1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000和1:1000000稀释接种的金黄色葡萄球菌在培养时到达稳定期的时间分别为2、4、6、8、10和12小时左右。1:1000稀释接种的菌液在培养5小时时的细菌数目(对数值)为8.3左右，1:100、1:10000、1:100000和1:1000000稀释接种的菌液在分别培养3、7、9和10小时左右时，菌液中的细菌数目(对数值)接近8.3左右，开始大量形成持留菌。
5.RNA-seq结果显示，高密度菌液和低密度菌液比较，差异上调表达基因对数期92个，稳定期52个，其中共同上调基因8个(pflB、NWMN_0163、coa、NWMN_0175、ldh1、pyrB、NWMN_2288、nrdG)；差异下调表达基因对数期134个，稳定期30个，其中共同下调基因3个(sarA、NWMN_1252、trpG)；共有差异基因的主要功能分布于细胞代谢和生物合成过程、转运与结合、代谢过程调节、细胞膜和细胞组分等。高密度菌液与低密度菌液共有的显著富集KEGG通路有双组分系统、氮代谢、丙酮酸代谢、丙酸代谢、氨基酸代谢、氧化磷酸化、氯烷烃和氯烯烃降解、嘧啶代谢、脂肪酸降解、核黄素代谢、次生代谢物的生物学合成、微生物在不同环境中的代谢、碳代谢通路。
6.本研究成功构建ΔNWMN_2288突变株，与野生株相比，ΔNWMN_2288在TSA上的菌落大小、颜色和生长速度未见明显变化，发酵甘露醇的能力有所减弱；1:1000稀释接种后培养至5小时和9小时时，ΔNWMN_2288对氨苄青霉素和诺氟沙星的持留能力下降；ΔNWMN_2288在高密度环境中持留能力同样降低，但在低密度环境中敲除株持留能力与野生株相比无明显差异。
结论：
1.菌液中的细菌密度是影响金黄色葡萄球菌持留菌形成的重要因素，发挥“开关”作用，当细菌数目(对数值)达到阈值8.3左右时，即可大量形成持留菌。
2.菌液中的细菌密度通过影响和调节双组分系统、氮代谢、丙酮酸代谢、丙酸代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、氧化磷酸化、氯烷烃和氯烯烃降解、嘧啶代谢、脂肪酸降解、核黄素代谢、次生代谢物的生物学合成、微生物在不同环境中的代谢、碳代谢通路，调控金黄色葡萄球菌持留菌的形成。
3.双组分系统中调控硝酸盐转运的NWMN_2288参与密度影响金黄色葡萄球菌持留菌形成的调控。
目的：
探讨菌液中的细菌密度对金黄色葡萄球菌持留菌形成的影响及分子机制。
方法：
1.将PBS洗涤后的对数期金黄色葡萄球菌Newman株菌液进行100倍浓缩，稳定期菌液进行1000倍稀释后制备成低密度菌液(对数期菌液和稳定期稀释菌液)和高密度菌液(稳定期菌液和对数期浓缩菌液)，放置6小时后，选用氨苄青霉素(10μg/mL)、诺氟沙星(200μg/mL)、庆大霉素(200μg/mL)和万古霉素(100μg/mL)进行抗生素暴露试验，测定不同生长期不同密度金黄色葡萄球菌菌液中持留菌的形成状况。同时进行低密度菌液和高密度菌液处理后立即开展抗生素暴露试验，测定菌液持留菌形成的变化。
2.将培养至稳定期的金黄色葡萄球菌菌液分别进行1:10、1:1000和1:100000稀释，选用氨苄青霉素、诺氟沙星、庆大霉素和万古霉素进行抗生素暴露试验，测定不同稀释度的稳定期金黄色葡萄球菌持留菌的形成状况。
3.开展低密度细菌和高密度细菌的饥饿实验，测定饥饿环境下密度对持留程度的影响；依据菌液稀释度，加入过氧化氢开展氧化应激试验，测定菌液密度的变化对金黄色葡萄球菌抗氧化能力的影响。
4.测定1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000和1:1000000倍稀释接种的金黄色葡萄球菌的生长曲线，以1:1000稀释接种的金黄色葡萄球菌菌液培养至5小时时的细菌数目为依据，从生长曲线上确定菌液1:100、1:10000、1:100000、1:1000000稀释接种后生长至相近菌量所需的时间，选取该时间点的前后各一个时间点进行氨苄青霉素暴露试验，测定各时间点金黄色葡萄球菌持留菌的形成能力。
5.收集金黄色葡萄球菌对数期和对数期浓缩菌液、稳定期和稳定期稀释菌液，采用Trizol法抽提总RNA，利用转录组测序(RNA-seq)测定不同生长期不同密度菌液中基因组转录水平，Q-PCR验证结果，并采用生物信息学分析，探讨密度影响金黄色葡萄球菌持留形成的分子机制。
6.利用同源重组技术，选用质粒pMX10，构建金黄色葡萄球菌基因敲除株ΔNWMN_2288。观察和对比ΔNWMN_2288在TSA上的生长状况及甘露醇发酵能力变化；通过开展野生株和ΔNWMN_2288的氨苄青霉素和诺氟沙星暴露试验，观察NWMN_2288对金黄色葡萄球菌不同生长期和不同密度菌液持留菌形成的影响。
结果：
1.对于浓缩或稀释后放置6小时的高密度菌液和低密度菌液，致死浓度的氨苄青霉素、诺氟沙星、庆大霉素、万古霉素均可以很好地杀伤低密度菌液(对数期/稳定期稀释)中的细菌，在药物分别作用5/3、1/2、3/1和4/2天后能够完全清除低密度细菌；而两种高密度菌液(对数期浓缩/稳定期)中的细菌均呈现出对药物的耐受性，氨苄青霉素和万古霉素对两种菌液作用10天均未能完全杀灭，诺氟沙星和庆大霉素分别作用6/7和6/7天才能够完全清除高密度细菌。密度改变处理后立即加药的不同密度菌液也显示出对抗菌药物类似的敏感性和耐受性。
2.不同稀释度的金黄色葡萄球菌稳定期菌液显示出不同的抗菌药物耐受性，其中1:10稀释后的细菌需氨苄青霉素和万古霉素作用8天才能够完全被清除，诺氟沙星和庆大霉素需作用5~6天才能够完全被清除；1:1000稀释后的细菌需氨苄青霉素和万古霉素作用2~4天即可完全被清除，诺氟沙星和庆大霉素需作用1~2天即可完全被清除；1:100000稀释后的细菌除氨苄青霉素需作用2天可完全被清除外，万古霉素、诺氟沙星和庆大霉素需作用1天即可完全清除细菌。
3.饥饿试验结果显示，对数期和对数期浓缩菌液及稳定期菌液在饥饿环境作用20天后均仍有许多细菌存活，而稳定期稀释菌液在饥饿环境中14天后全部死亡。过氧化物应激试验结果显示，金黄色葡萄球菌耐受试验浓度的过氧化氢的能力不同，对低密度菌液的杀伤作用强于高密度菌液。
4．生长曲线显示，1:10、1:100、1:1000、1:10000、1:100000和1:1000000稀释接种的金黄色葡萄球菌在培养时到达稳定期的时间分别为2、4、6、8、10和12小时左右。1:1000稀释接种的菌液在培养5小时时的细菌数目(对数值)为8.3左右，1:100、1:10000、1:100000和1:1000000稀释接种的菌液在分别培养3、7、9和10小时左右时，菌液中的细菌数目(对数值)接近8.3左右，开始大量形成持留菌。
5.RNA-seq结果显示，高密度菌液和低密度菌液比较，差异上调表达基因对数期92个，稳定期52个，其中共同上调基因8个(pflB、NWMN_0163、coa、NWMN_0175、ldh1、pyrB、NWMN_2288、nrdG)；差异下调表达基因对数期134个，稳定期30个，其中共同下调基因3个(sarA、NWMN_1252、trpG)；共有差异基因的主要功能分布于细胞代谢和生物合成过程、转运与结合、代谢过程调节、细胞膜和细胞组分等。高密度菌液与低密度菌液共有的显著富集KEGG通路有双组分系统、氮代谢、丙酮酸代谢、丙酸代谢、氨基酸代谢、氧化磷酸化、氯烷烃和氯烯烃降解、嘧啶代谢、脂肪酸降解、核黄素代谢、次生代谢物的生物学合成、微生物在不同环境中的代谢、碳代谢通路。
6.本研究成功构建ΔNWMN_2288突变株，与野生株相比，ΔNWMN_2288在TSA上的菌落大小、颜色和生长速度未见明显变化，发酵甘露醇的能力有所减弱；1:1000稀释接种后培养至5小时和9小时时，ΔNWMN_2288对氨苄青霉素和诺氟沙星的持留能力下降；ΔNWMN_2288在高密度环境中持留能力同样降低，但在低密度环境中敲除株持留能力与野生株相比无明显差异。
结论：
1.菌液中的细菌密度是影响金黄色葡萄球菌持留菌形成的重要因素，发挥“开关”作用，当细菌数目(对数值)达到阈值8.3左右时，即可大量形成持留菌。
2.菌液中的细菌密度通过影响和调节双组分系统、氮代谢、丙酮酸代谢、丙酸代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、氧化磷酸化、氯烷烃和氯烯烃降解、嘧啶代谢、脂肪酸降解、核黄素代谢、次生代谢物的生物学合成、微生物在不同环境中的代谢、碳代谢通路，调控金黄色葡萄球菌持留菌的形成。
3.双组分系统中调控硝酸盐转运的NWMN_2288参与密度影响金黄色葡萄球菌持留菌形成的调控。