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细胞遗传不稳定性（genetic instability）是存在于人类遗传疾病及肿瘤中的一种重要现象，可能在其发生中起主导作用。环境致癌性理化因子可诱发细胞遗传不稳定性。我们的研究发现化学致癌物MNNG可在哺乳动物细胞中诱发以非定标性突变（nontargeted mutation）为特征的遗传不稳定性，并且认为可能是通过DNA损伤及非DNA损伤途径激活信号转导系统而诱导细胞内众多基因的表达发生改变，致使细胞内DNA聚合酶酶谱发生变化启用了低保真度的DNA聚合酶，从而导致细胞遗传不稳定性的形成。 近年来的研究发现生物体细胞内存在有DNA损伤耐受机制，并且发现其实质就是DNA跨损伤合成（translesion synthesis，TLS）。自1996年以来，已在原核及真核生物细胞中陆续发现了多种参与跨损伤DNA合成的DNA聚合酶，这类跨损伤合成酶能以无误（error-free）和/或易误（error-prone）（致突变，mutagenic）方式跨越（bypass）模板链上的DNA损伤，且大多数成员其复制保真度低下，缺乏3’→5’校正（proofreading）功能。 MMS2基因编码产物是酿酒酵母（S.cerevisiae）细胞内无误性跨损伤DNA合成旁路中的一个调节因子。MMS2基因的编码产物是一泛素缀合酶样蛋白（ubiquitin-conjugating enzyme-like protein，Ubc-like protein），其氨基酸序列及二、三级结构类似于泛素缀合酶（ubiquitin-conjugating enzyme，UBC，E2），但它由于缺乏关键性的一个半胱氨酸残基而不具备泛素缀合酶的泛素缀合活性。泛素缀合途径参与细胞的多种代谢过程，包括DNA损伤修复、细胞周期调控及应激反应等。泛素缀合酶样蛋白在体内可能以E2酶显性负变异体（dominant negative variant）的形式起作用，它可能是蛋白泛素化的新的调节因子。MMS2基因编码产物介导了酵母细胞内的二个分别以RAD5和 RAD30为代表的无误性跨损伤 DNA合成旁路途径。研究发现酵母 mmsZ基因无功效突变株对甲基甲磺酸及UV中度敏感，其自发突变率明显升高。mmsZ基因突变株不影响REV3介导的易误性旁路途径，酵母mmsZ基因突变株表现为REV3依赖性增变表型。 hMMSZ、CROC－1是近年在人细胞中找到的两个与芽生酵母MMSZ基因同源的新基因，它们的编码产物也是泛素缀合酶样蛋白，与酵母MMSZ基因编码产物分别具有约 50％和 75％的氨基酸序列相似性。已有的人体细胞研究资料提示，CROC－I基因可能通过调控细胞分化及改变细胞周期相的分布状态米参与人体细胞的癌变过程，它可能是人细胞的一个癌基因。hMMSZ基因目前还无直接的人体细胞研究资料。但却发现hMMSZ和CROC－1基因两者都能功能性补救酵母mmsZ基因缺陷株对烷化剂MMS及UV的敏感性及自发性突变，并且还发现hMMSZ和酵母MMSZ基因两者都能在Rat－l细胞短暂共转染试验中转录檄活CghS－CAT报告基因。因此，推测hMMSZ、CROCI基因与酵母MMSZ基因之间功能保守。 本研究是根据我们的遗传不稳定性形成机制理论结合酵母同源基因MMSZ的功能而提出的，关键是为了研究hMMSZ、CROC．I基因与MtNNG诱发的以非定标性突变为特征的人细胞遗传不稳定性形成之间的关系。为此，本研究运用反义策略分别构建了可诱导表达hMMSZ、CROCj基因反义RNA（antisense RNA）的真核细胞表达质粒，通过转染人羊膜FL细胞，分别建立可诱导反义阻断hMMy。CROC－1基因功能的人FL－hMMSZ－。FL－CROC、广细胞系，以此作为实验模型，研究hMMSZ、CROC－1基因的一系列生物学功能。hMMSZ、CROCI基因反义RNA表达质粒的构建 用限制性内切酶分别从重组有hMMSZ、CROC－1基因全长C洲A序列的克隆质粒呷S十。pBS－CIB上切出包含相应靶基因整个开放阅读框的CDNA片断，用修饰酶将切出的目的片断两端切平或补平，透析袋回收纯化目的片段。再用连接酶在已切平或补平的目的片断两端连上Sail连接于，经限制性内切酶Sal酶切使目的片段两端生成Sail粘性末端，最后将目的片段分别克隆到改建的真核细胞地塞米松诱导表达载体pMAMneo－amp”的Sail位点上。通过限制性内切酶酶切图谱（Restriction map）分析，筛选出反向插入的重组质粒。构建好的 hMMSZ重组质粒经 Nhe、BstX双酶切后得到 553hp及 8．7 kb 2条带，此即为反向插入的重组质粒pMAM－anti－hMMSZ；而构建好的CROC－］ 3重组质粒经Nh el酶切后得到2％…及gM 2条带，此即为反向插入的重组质粒pMAM－MICROC．］o转基因细胞系的建立 用改良的磷酸钙法将构建好的反向重组质粒pMAM－ant卜hMMSZ、pMAM－anti－CROC－1分别转染培养的人羊膜FL细胞，通过G418筛选，2－3周后各得到十几个G418抗性细胞集落，分别进一步扩大培养成FL。hMMSZ、FLCROC－］细胞系。同时用余本质粒pMAMneo－amp”转染FL细胞，建立载体对照细胞系FL－MAMneo。转基因细胞系中靶基因反义RNA的转录情况分析 针对插入的各个靶基因片断分别设计一对PCR引物，用上游引物（正义引物）作为逆转录反应的特异性