痰湿体质具有免疫遗传学基础,与后天生活习惯密切相关,呈现胰岛素抵抗及代谢性炎症状态,是多种代谢性疾病的“土壤”。非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）,是一种具有遗传、环境、代谢和压力相关成分的疾病,主要与胰岛素抵抗有关,是代谢综合征的重要组成部分,因而,NAFLD可作为痰湿体质的疾病模型进行具体研究。化痰祛湿方是基于“体病相关”和“体质可调”所创,用于调理痰湿体质及其导致的相关代谢性疾病,成分众多复杂,药理作用具有多靶点性,目前尚未对其整体的药效机理形成全面的认识,为此,我们迫切需要有效的研究思路和方法来对其药效物质基础进行研究,并在此基础上分析其有效成分、药效及作用机理。论文共分为三个部分。目的:对化痰祛湿方入血成分进行分析,为药效机制研究奠定物质基础。基于网络药理学探讨化痰祛湿方改善NAFLD的分子靶点和途径,利用分子对接进一步筛选,动物实验进行验证。基于肠道菌群分析探讨肠道菌群是否介导了化痰祛湿方对NAFLD的改善作用。最后基于痰湿体质人群进行差异miRNA分析,初步探索miRNA是否介导了化痰祛湿方对痰湿体质人群的改善。为中医复方研究提供了思路和方法,并为改善痰湿体质及NAFLD提供新的思路。方法:1.使用UHPLC MS/MS对化痰祛湿方入血成分进行了全面的辨识,利用网络药理学对化痰祛湿方改善NAFLD的靶点和通路进行了研究,并模拟分子对接进一步筛选,最后通过动物实验对重要通路进行验证。2.SD大鼠连续造模及给药8周,进行肠道菌群物种组成分析、群落结构分布、alpha多样性分析、beta多样性分析、物种差异性分析及PICRUST功能预测,分析探讨肠道菌群是否介导了化痰祛湿方对NAFLD的改善作用。3.8例痰湿体质受试者接受了 3个月的化痰祛湿方调理,在基线以及干预1个月和3个月采集血液,检测相关的生化指标,提取外周血单核细胞,高通量测序分析差异miRNA,进行功能及通路富集,并且对差异miRNA及其靶向调控基因进行RT-qPCR验证。由于数据缺失,使用SPSS进行了含缺失值的重复测量资料混合线性模型分析。结果:1.通过UHPLC MS/MS解析化痰祛湿方金丝桃苷、表儿茶素等28种化合物。然后,我们从Pubchem等5个数据库中找到1245个成分靶点。通过分析4个数据库、8个GEO基因数据集及5篇文献对挖掘获得差异蛋白及差异基因,获得5136个NAFLD候选基因,选择PPI网络中置信度＞0.9的靶点有1733个,映射后,共有431个共有靶点。之后,进行网络分析以筛选关键网络和核心目标。找到芥子酸、槲皮素、木犀草素等10个关键化合物。GO和KEGG分析根据Count≥10、P≤0.01、FDR≤0.05筛选后得出化痰祛湿方中化合物的靶点蛋白有124个基因功能和57条信号通路中的作用。通过分子对接筛选了包括 PIK3CA、BACE1、ESR1、PIM1、SRC、AKT1、VEGFA、TP53、STAT3 9个靶点进一步进行分子对接,对接得分较好。动物实验,化痰祛湿方连续造模及给药8周后,与空白对照组相比较,模型组大鼠血清TC、LDL-C、AST、肌酐均显著升高（P＜0.01）。模型组大鼠血糖、胰岛素、胰岛素抵抗、ALT、尿素氮均没有明显差异（P＞0.05）。连续给药8周后,与模型组相比,中药组和阳性药物组血清LDL-C、胰岛素均没有明显降低（P＞0.05）。中药组和阳性药物组TC、血糖、胰岛素抵抗均显著降低（P＜0.01）。且中药组和阳性药物组之间TC、血糖、胰岛素抵抗、AST、肌酐均没有显著差异（P＞0.05）。与空白对照组相比较,中药组和阳性药物组ALT、尿素氮均未明显升高（P＞0.05）。NAFLD SD大鼠模型血脂升高、肝脏炎症指标升高。中药组和阳性药物组均可以降低血脂、血糖、胰岛素抵抗,且效果相当。中药和阳性药物均未出现肝肾毒性。病理切片显示中药组和阳性药物组能在一定程度上减少肝脏细胞脂肪沉积。采用Western Blot方法对PI3K/AKT通路上的PI3K、AKT、P27等关键蛋白进行检测,PI3K、AKT、IKK、MDM2模型组磷酸化水平升高,中药组和阳性药物组磷酸化水平降低;P27、P21模型组磷酸化水平降低,中药组和阳性药物组磷酸化水平升高。表明化痰祛湿方对该通路起到了调节作用。2.肠道菌群实验,化痰祛湿方连续造模及给药8周,在属水平上分析差异物种,挑选差异物种丰度Top10的做相对丰度boxplot分析,ANOVA分析后利用LEfSe揭示两组菌群差异物种的组成,包括差异物种注释分析和差异物种对差异贡献度大小分析。模型组与空白对照组比较,LachnospiraceaeUCG 010为空白对照组的优势菌种（P＜0.01）。模型组相与中药组比,Muribaculum、Ruminococcaceae UCG 013菌属为中药组的优势菌属（P＜0.01）,FamilyⅩⅢAD3011group、Anaerotruncus、Oscillibacter、菌属为模型组的优势菌属（P＜0.01）。PICRUST功能预测分析,化痰祛湿方组与模型组比较,符合筛选条件的差异通路富集130条信号通路,其中包括Pathways in cancer、MAPK signaling pathway、Phosphatidylinositol signaling system、PPAR signaling pathway、Protein folding and associated processing、Antigen processing and presentation、Type Ⅱ diabetes mellitus、Ubiquitin system、Adipocytokine signaling pathway、Glycolysis/Gluconeogenesis、Citrate cycle（TCA cycle）、Glycosyltransferases 等,主要涉及糖脂代谢、胰岛素抵抗、免疫调节及线粒体功能。3.痰湿体质受试者经过3个月的治疗,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）在不同时间点均呈上升趋势（P＜0.001）,而空腹血糖,空腹胰岛素（FINS）和糖化血红蛋白（HbA1c）的水平在不同时间点均呈下降趋势（所有P＜0.05）。经过miRNA高通量测序后,与基线相比,筛选1个月和3个月时的差异miRNA,并进行了靶基因预测和KEGG通路富集分析。结果显示,与代谢疾病相关的途径主要包括Pathways in cancer,PI3K/Akt信号传导通路等。此外,RT-qPCR显示hsa-miR-1237-3p具有统计学差异（P=0.036）。然后,我们在“Pathways in cancer”通路中验证了 hsa-miR-1237-3p的靶基因,包括SDF1,AC,CRK和HGF,也被称为PI3K/AKT通路的上游靶基因。结果表明,CRK和HGF两项指标具有统计学意义（分别为P=0.045和P=0.036）。结论:化痰祛湿方通过药物成分-靶标-相互作用网络改善NAFLD,为多个化合物（金丝桃苷、芦丁、绿原酸、木犀草素、原儿茶酸等）、多靶点（PI3K、AKT、BACE1、ESR1、SRC、TP53、VEGFA 等）、多通路（MAPK 通路、NF-κB 通路、JAK2/STAT3 通路、PI3K/AKT通路、TLR通路等）甚至多为多个化合物共同作用一个通路的多个靶点（如野漆树苷、芦丁、柚皮苷、柚（苷）配基-7-O-葡糖苷作用于PI3K,芦丁、原花青素作用于AKT,共同调控PI3K-AKT通路）,进而控制食物摄入、抑制糖原、脂肪酸和胆固醇的合成、促进脂肪酸氧化、葡萄糖转运、控制炎症、提高肝脏及外周组织对胰岛素的敏感性及减少脂肪沉积,这些均有利于改善NAFLD的发生。肠道菌群很可能参与多条通路从而介导了化痰祛湿方发挥作用。此外,肠道菌群通过诱导巨噬细胞分化为抗炎的M2型巨噬细胞,发挥免疫抑制作用,维持维生素K稳态,改善线粒体功能,还可以预防蛋氨酸胆碱缺乏症引起的肝脏弥漫性脂肪变性。化痰祛湿方可通过调节hsa-miR-1237-3p作用于靶标CRK和HGF,并可能对其下游PI3K/AKT通路产生影响,从而改善痰湿体质。肠道菌群可能介导化痰祛湿方改善NAFLD的作用,但我们的数据仅基于观察性研究而得出结论,这些发现是NAFLD的原因还是与NAFLD伴随发生,还需要进一步使用抗生素或使用无菌小鼠联合粪菌移植进一步验证,进而对主要起作用的单一菌种进行筛选。我们的结果有可能提供NAFLD的早期标记,NAFLD发病之前识别高危患者,完善治疗策略,通过调节肠道菌群为痰湿体质或NAFLD的早期改善提供可能性。与此同时,研究方法为中医复方的探析提供了一些新颖的思路。