研究目的苯是广泛存在于职业环境和生活环境中的污染物,1982年被国际癌症研究机构(IARC)确定为环境致癌物质。在我国,慢性苯中毒连续多年位于慢性职业中毒原因的首位。吸烟和汽车尾气的排放是生活环境中苯的主要来源,苯污染已经成为亟待解决的环境污染问题。苯具有血液毒性,诱发血细胞减少,再生障碍性贫血,粒细胞白血病等,早期以外周血白细胞减少症为主要特征。苯的毒性作用尚无明确的阈值,流行病学的资料发现,即使空气中的苯暴露浓度低于1ppm,职业工人的外周血白细胞和血小板计数明显低于对照组,因此,日常生活生活中预防苯中毒显得尤为重要,开发有效的营养策略来防治环境中的苯中毒具有重要的理论和现实意义。大蒜在受到切割、挤压等处理时,大蒜中的蒜氨酸酶被激活,催化蒜氨酸转化为大蒜素,迅速被代谢分解生成多种有机硫化物(OSCs),如二烯丙基一硫(DAS),二烯丙基二硫(DADS),二烯丙基三硫(DATS)、烯丙基甲基硫化物(AMS)、S-烯丙基半胱氨酸(SAC)和S-烯丙基巯基半胱氨酸(SAMC)等。已知大蒜中的有机硫化物具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗菌、化学预防作用等生物活性。尤其是大蒜有机硫化物能通过促进化学毒物的解毒和排出,从而发挥化学预防作用。王硕等人的研究发现,二烯丙基三硫能通过调节代谢酶细胞色素P450酶,拮抗正己烷诱导的周围神经损伤。曾涛等人的研究表明,在荷瘤小鼠中,大蒜油(大蒜脂溶性提取物)能抑制化疗药物环磷酰胺和放射治疗诱导的外周血白细胞减少症。我们前期的研究也发现,大蒜油能拮抗苯诱导的外周血白细胞减少症,但其有效成分和作用机制尚不明确。有研究表明,大蒜有机硫化物的生物活性可能与硫集团数目有关。因此,本研究选用大蒜提取物中含有三个有机硫基团的二烯丙基三硫(DATS)作为干预药物,经口灌胃建立苯诱导白细胞减少症的动物模型,观察二烯丙基三硫对苯诱导的外周血白细胞减少症的拮抗作用,并从抗细胞凋亡、抗氧化、调节苯代谢、PI3K/Nrf2/ARE通路调节四个方面,分析其可能的作用机制。以期为开发二烯丙基三硫的药效作用提供理论依据,为慢性苯中毒的防治提供营养防治策略。研究方法1.观察大蒜的三种有机硫制剂对苯诱导的白细胞减少症的预防作用。昆明小鼠110只,随机分为11组,即空白对照组、模型组、大蒜匀浆(GH)低、高剂量干预组、大蒜匀浆对照组、大蒜油(GO)低、高剂量干预组、大蒜油对照组、二烯丙基三硫(DATS)低、高剂量干预组和DATS对照组。除空白对照组和苯模型组外,分别用GH,GO和DATS经口灌胃进行干预,2h后,苯模型组和各干预组经口给与苯-玉米油混悬液(1.3g/kg BW)染毒,对照组给与同等体积的玉米油,每天一次,共21天。全自动血球计数仪检测外周血中白细胞计数(WBC),分离肝脏、脾脏和胸腺,计算脏器指数和肝脏、脾脏组织切片病理学检查,观察三种大蒜制剂对苯诱导的靶器官损伤的保护作用,并比较可能的不良事件。2.PI3K-Akt通路介导的细胞凋亡和抗氧化作用在DATS拮抗苯诱导的外周血细胞减少症中的作用60只雄性SD大鼠随机分为6组,分别为:空白对照组,模型组,DATS低、中、高干预组和DATS对照组,每组10只。3个DATS干预组分别经口给予DATS(15,30,45mg/kg BW),2h后,除了 2个对照组给与同体积玉米油外,其余4组大鼠均经口灌胃苯-玉米油混悬液(1.3g/kgBW)建造苯诱导白细胞减少症动物模型,每天1次。28天后,经腹主动脉取血,检测外周血细胞计数。分离外周血中的单个核细胞(PBMCs)和股骨中的骨髓细胞(BMCs),分别用流式细胞仪检测细胞凋亡水平,Weston blot检测凋亡相关蛋白和PI3K-Akt通路蛋白的表达。测定细胞内活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)水平评估氧化应激水平,检测非酶性抗氧化物质还原型谷胱甘肽(GSH)水平,抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性,评估抗氧化能力。3.苯体内代谢的调节在DATS拮抗苯诱导的外周血白细胞减少症的中毒作用50只雄性SD大鼠随机分为5组,即空白对照组,模型组,DATS低、高干预组和DATS对照组,每组10只。DATS干预组和对照组大鼠分别经口灌胃不同剂量DATS(15,30mg/kg.BW),其他组给与同体积玉米油,2h后,除对照组外,经口灌胃苯(1.3g/kg/d)建造苯诱导外周血白细胞减少症模型,每天1次,共28天。收集24小时尿液,高效液相色谱分析尿中苯代谢物苯巯基尿酸(SPMA)和反式-反式粘糠酸(t,t-MA)的含量;腹主动脉取血,全自动血球计数仪分析外周血细胞计数,化学法检测肝脏代谢酶细胞色素P450 2E1(CYP2E1)、谷胱甘肽-S-转移酶GST和骨髓组织中代谢酶髓过氧化物酶酶(MPO)、NADPH:醌氧化还原酶(NQO1)的活性,Western Blot检测这些代谢酶的蛋白表达水平。4.H3K/Nrf2/ARE信号通路介导的Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶在DATS拮抗苯诱导的外周血白细胞减少症中的作用。60只雄性SD大鼠随机分为4组,分别为:空白对照组,模型组,DATS干预组和DATS对照组,每组15只。DATS干预组和DATS对照组经口给予DATS(30 mg/kg BW),2h后,模型组和DATS干预组大鼠均经口灌胃苯-玉米油混悬液(1.3g/kg BW)建造苯诱导白细胞减少症模型,其余组给同体积玉米油,每天1次。28天后,经腹主动脉取血,提取外周血单核细胞和骨髓细胞,测定ROS和MDA的水平,Western blot测定Ⅱ相代谢酶NQO1、GST和抗氧化酶SOD、GSH-Px的蛋白表达水平,PI3K/Nrf2/ARE信号通路相关蛋白p-PI3K、p-Akt、Nrf2和Keapl的蛋白表达水平,并分析DATS对PI3K/Nrf2/ARE信号通路及下游基因的调控作用。结果1.观察大蒜的三种有机硫制剂对苯诱导的白细胞减少症的预防作用。结果显示,模型组小鼠外周血白细胞计数降低至对照组的41.31%(p<0.01),而大蒜匀浆(400mg/kg)、大蒜油(60mg/kg)和DATS(30mg/kg)干预后,外周血白细胞计数分别比模型组增加了 144.04%,140.07%和148.34%,各干预对照组与空白对照组比较,差异无统计学意义。肝脏指数在各组间无统计学差异,病理检查未发现异常,而苯模型组小鼠的脾脏指数和胸腺指数分别比空白对照组降低44.99%和54.04%,脾结节减少,胸腺萎缩。而三种大蒜制剂干预后,脾脏和胸腺指数均明显增高,仅大蒜匀浆(400mg/kg)和大蒜油(60mg/kg)对照组,小鼠脾脏肿大,脾脏指数比空白对照组高32.03%和28.61%(p<0.05)。苯染毒后,小鼠体重明显下降,三种干预均能在一定程度上使体重恢复增长,但DATS效果最好。2.PI3K-Akt通路介导的细胞凋亡和抗氧化作用在DATS拮抗苯诱导的外周血细胞减少症中的作用模型组大鼠外周血白细胞(WBC)和红细胞(RBC)计数分别降低至对照组的31.0%和79.2%。而DATS(30,45mg/kg)能有效抑制外周血细胞的减少。流式细胞仪检测细胞凋亡水平的结果显示,模型组大鼠外周血单核细胞和骨髓细胞的凋亡率分别增至对照组的274%和284%。Weston blot的实验结果显示,细胞凋亡相关蛋白Bcl-2表达下调,Bax和活化的caspase-3的蛋白表达上调,磷酸化PI3K和Akt蛋白表达下调。而DATS干预能有效抑制这些反应,并呈剂量依赖趋势。相对于模型组,在30,45 mg/kg DATS干预组中,DATS干预使外周血WBC数量增加至267.1%和304.8%,而RBC数量增加至108.6%和117.7%。细胞凋亡水平下降,凋亡相关蛋白的表达水平也相应恢复,PI3K/Akt通路相关蛋白的表达水平也恢复正常水平。苯染毒后,模型组中大鼠的PBMCs和BMCs氧化应激水平增强,PMBCs中的ROS和MDA水平分别增高3.4和1.5倍,BMC中的ROS和MDA水平分别增高3.3和2.2倍。PBMCs和BMCs中的GSH水平分别降低42.7%和45.2%,抗氧化酶SOD、GSH-Px和GR活性均下降。DATS干预后,细胞中氧化应激参数下降,氧化酶活性增强,GSH含量增加,并呈一定的剂量依赖性。3.苯体内代谢的调节在DATS拮抗苯诱导的外周血白细胞减少症的中毒作用苯暴露后,大鼠外周血白细胞计数比空白对照组降低了 65.5%,尿中可检测到两种苯代谢物。DATS干预后,大鼠外周血白细胞计数比模型组分别增高0.64和1.67倍,尿中t,t-MA水平分别降低了 19.84%和53.68%,而SPMA水平增加了 0.55倍和0.92倍。苯暴露后,参与苯活化代谢的代谢酶CYP2E1和MPO的酶活性分别增高为对照组的1.80倍和3.03倍,而参与苯解毒代谢的GST和NQO1的酶活性分别减低为对照组的70.53%和42.44%,酶蛋白表达水平也表现为类似变化。DATS干预后这一现象可明显逆转,特别在DATS(30mg/kg)干预组中,CYP2E1和MPO的酶活性和蛋白表达水平明显低于对照组,而GSTT1和NQO1酶活性和蛋白表达水平明显高于对照组(p<0.05)。4.PI3K/Nrf2/ARE信号通路介导的Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶在DATS拮抗苯诱导的外周血白细胞减少症中的作用。苯模型组大鼠的WBC比空白对照组降低了 67.66%,RBC降低了 20.8%。DATS干预后,大鼠WBC和RBC分别比模型组增加了 1.56倍和0.11倍。苯模型组大鼠的PBMCs和BMCs中氧化应激水平增高,参数ROS分别增加了 2.45倍和2.08倍,MDA水平分别增加2.23倍和1.48倍,而抗氧化酶(SOD和GSH-Px)和Ⅱ相代谢酶(GST和NQO1)蛋白表达水平下调。DATS处理后,氧化应激水平下降,抗氧化酶和Ⅱ相代谢酶蛋白表达均上调。细胞内磷酸化的PI3K和磷酸化的Akt蛋白表达上调,Keap1蛋白表达下调,核内Nrf2蛋白表达上调,PI3K/Nrf2/ARE信号通路活化。结论1.生大蒜匀浆、大蒜油和DATS三种大蒜制剂均能有效拮抗苯诱导的外周血白细胞减少症,其中DATS预防效果和安全性最好。2.DATS能通过激活抗氧化酶和提高非酶性抗氧化物的水平,拮抗外周血单核细胞和骨髓细胞中苯诱导的氧化应激。3.苯诱导的外周血细胞减少可能与氧化应激诱导的外周血单核细胞和骨髓细胞凋亡有关,DATS能通过调节细胞凋亡有效拮抗苯诱导的血细胞减少症,激活PI3K/Akt通路可能是DATS调节氧化应激诱导的细胞凋亡的重要机制。4.DATS通过抑制代谢酶CYP2E1和MPO介导的苯代谢活化和激活GSTT1和NQO1介导的苯解毒代谢过程,从而减少有毒代谢产物的生成,拮抗苯诱导的白细胞减少症。5.DATS通过PI3K/Nrf2/ARE信号通路增强抗氧化酶介导的抗氧化作用和促进Ⅱ相代谢酶介导的解毒代谢过程,从而拮抗苯诱导的血液毒性和细胞毒性。