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背景：免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia, ITP)是一种获得性免疫性疾病,是因自身反应性T和B细胞被血小板自身抗原激活,产生免疫介导的血小板破坏和／或血小板生成减少的自身免疫性疾病,是临床上最常见的出血性疾病。目前,肾上腺糖皮质激素作为治疗成人ITP的首选药物,有效率70%-80%。吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase, IDO)是色氨酸沿犬尿氨酸途径分解的关键酶和限速酶,色氨酸是细胞存活和增殖过程中不可少的必须氨基酸。T细胞对色氨酸耗竭敏感,色氨酸浓度较低时,可阻止T细胞的增殖。色氨酰tRNA合成酶(Tryptophanyl-tRNAsynthetase, TTS)可以将色氨酸加载到它特异的tRNA上,形成的色氨酰—tRNA复合物,构成了蛋白质合成的色氨酸库,拮抗了IDO对T细胞的增殖抑制作用。本研究通过检测ITP患者大剂量地塞米松治疗前后色氨酸代谢途径的变化,比较治疗有效和无效者的变化规律,预测ITP病人对激素治疗的敏感性。目的：1.大剂量地塞米松治疗ITP的临床疗效观察；2.探讨IDO介导的色氨酸代谢途径在ITP发病中的作用；3.根据大剂量地塞米松治疗前后色氨酸和犬尿氨酸浓度、IDO和TTS的表达量及活性,比较治疗有效和无效者的变化规律。方法：1.研究对象的选取：初诊或复发ITP患者20例,符合ITP的诊断标准；排除糖尿病、高血压、消化道溃疡、肝炎及结核等急慢性感染性疾病；采样之前至少一个月未使用糖皮质激素或免疫抑制剂进行治疗,纳入对象均采用地塞米松40mg/d×4天的标准方案治疗。在治疗前和治疗后一周采集标本。正常对照标本20例,未做任何处理。2.外周血单个核细胞(PBMCs)的分离：采集健康人和ITP患者EDTA抗凝血标本10ml,无菌条件下,Ficoll-Hypaque分离液梯度离心。分离的PBMCs用PBS洗涤两次,并用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调整为1-2×106/ml的浓度。3.T淋巴细胞增殖抑制率检测：将分离的PBMCs用培养基调整细胞浓度至5×105/ml,接种于96孔板,设置空白组、阴性对照组和实验组,每组设3个复孔。每孔5×105个细胞,实验组加入1-甲基色氨酸(1-MT),空白组与阴性对照组不加。培养48小时,在培养结束后加入CCK-8试剂,继续培养4小时,使用酶标仪读取每孔OD值,计算细胞的增殖抑制率。4.血浆中色氨酸和犬尿氨酸的浓度检测：采集的标本离心,分离血浆,采用液相-质谱联用分析系统(LC-MS/MS)检测血浆中色氨酸和犬尿氨酸浓度,判断IDO的活性。5.IDO和TTS的表达：流式细胞仪检测PBMCs.CD4+T细胞、CD8+T细胞中IDO和TTS的表达率,RT-PCR检测IDO和TTS的mRNA表达。结果：1.大剂量地塞米松治疗ITP病人的有效率为80%。2.血浆色氨酸和犬尿氨酸浓度：ITP患者治疗前与正常对照比,血浆色氨酸(Trp)浓度(8.776±1.398umol/L vs.4.456±0.747umol/L,P<0.05),犬尿氨酸(Kyn)浓度(0.132±0.034um01/L vs.0.106±0.039umol/L,P<0.05),及Kyn/Trp比值(0.018±0.00lumol/L vs.0.013±0.00luml/L,P<0.05)都显著升高；大剂量地塞米松治疗后,有效组与治疗前比较,Trp浓度(3.047±0.209umol/L vs.8.776±1.398umol/L,P<0.05)降低,Kyn浓度(0.175±0.008umol/L vs.0.132±0.034umol/L,P<0.05)和Kyn/Trp比值(0.025±0.003umol/L vs.0.018±0.00lumol/L,P<0.05)都升高。无效组Trp浓度(7.736±1.630um01/L vs.8.380±0.841um01/L,P>0.05).Kyn浓度(0.091±0.042um01/L vs.0.113±0.073umol/L,P>0.05)和Kyn/Trp匕值(0.016±0.006umol/L vs.0.017±0.007umol/L,P>0.05)较治疗前无明显变化。3.T细胞增殖抑制率：治疗后,T细胞增殖抑制率明显低于治疗前(0.7430±0.0076vs.1.3803±0.0257),差异有统计学意义(P<0.05),证明大剂量地塞米松通过IDO起作用,诱导IDO的高表达,明显抑制T细胞的增殖。治疗后加入IDO的抑制剂1-MT后,T细胞增殖明显升高(1.2827±0.0168vs.0.7430±0.0076),P<0.05,差异有统计学意义。4.FCM检测IDO和TTS表达结果：ITP患者治疗前,与正常对照比较,PBMCs中IDO(456.67±51.59vs220.33±51.79,P<0.01)和TTS(1430.34±113.29vs774.67±67.17P<0.05)的平均荧光强度(MFI)均升高；在CD4+T细胞(183.35±39.01vs508.67±47.01,P<0.01)和CD8+T细胞(141.00±16.09vs241.00±57.86,P<0.05)中IDO表达降低,而TTS在CD4+T细胞(4319.37±120.25vs1812.44±93.73)和CD8+T细胞(5267.67±436.51vs1308.00±118.51,P<0.01)中表达显著升高；与治疗前比较,治疗后有效组TTS在PBMCs(830.51±79.38vs1430.34±113.29.P<0.01).CD4+T细胞(1127.46±188.32vs4319.37±120.25,P<0.01).CD8+T细胞(1710.33±191.92vs5267.67±436.51,P<0.01)中表达都显著下降,而IDO在PBMCs(517.00±69.78vs456.67±51.59,P<0.05).CD4+T细胞(935.34±61.87vs183.35±39.01,P<0.01) and CD8+T细胞(828.12±63.15vs141.00±16.09,P<0.01)的表达都上升,P<0.05；无效组IDO和TTS在PBMCs[(393.37±57.25vs363.45±42.78).(1255.75±112.29vs1323.25±108.34)P>0.05],CD4+T细胞[(152.07±23.45vs172.12±20.33).(4309±167.28vs4211±87.64)P>0.05]和CD8+T细胞[(132.35±11.57vs126.41±19.60).(5249.00±422.95vs4987.75±344.84)P>0.05]上的MFI和治疗前比较无明显差异。5.IDO和TTS mRNA表达结果：治疗前,IDO mRNA(0.457±0.003vs0.040±0.001)和TTS mRNA(0.624±0.052vs0.040±0.001)的表达量较正常对照升高,P<0.05；治疗后,有效组ID0mRNA的表达较治疗前比没有明显差异(0.423±0.004vs0.457±0.003P>0.05),TTS mRNA的表达较治疗前下降(0.0235±0.002vs0.624±0.052P<0.05)。结论：大剂量地塞米松对短期提升ITP病人的血小板计数疗效显著。在ITP患者中,IDO和TTS的表达存在异常,ID0/TTS介导的色氨酸代谢途径在ITP发病机制中起作用。大剂量地塞米松治疗ITP患者后,能够诱导IDO的高表达,下调TTS的表达,抑制T细胞的增殖,通过分析IDO和TTS的表达情况,可以预测ITP病人对激素治疗的敏感性。通过研究T细胞上调控IDO和TTS表达的机制,为ITP的治疗提供一个新的方向。